蛋白質直接電化學和去折疊及與小分子相互作用的研究.pdf

1、研究蛋白質的直接電子傳遞、蛋白質折疊/去折疊的構象變化及其與小分子的相互作用，可以獲得蛋白質的熱力學和動力學性質的重要信息，以及藥物等小分子與蛋白質相結合的動態(tài)信息，為構筑新型第三代電化學生物傳感器提供了重要基礎。本課題的研究有助于理解和認識蛋白質的結構和功能之間的關系，對于蛋白質的定量檢測和新藥的開發(fā)也具有重要意義。本論文共分5章，其主要內容分別如下： 1.綜述了蛋白質的直接電化學、蛋白質的折疊/去折疊、蛋白質與小分子化合物的

2、相互作用三方面的研究意義、方法和進展等。簡述了本論文的選題意義和主要內容。 2.構建了新的蛋白質薄膜修飾電極體系，實現(xiàn)了辣根過氧化物酶(HRP)的直接電化學和生物催化作用。殼聚糖穩(wěn)定的納米金(AuCS)與片狀剝落的粘土(Clay)納米片通過靜電相互作用進行雜化，制備得到粘土—殼聚糖—納米金復合物(Clay/AuCS)。HRP被固定在Clay/AuCS修飾的玻碳電極上，最后再覆蓋一層粘土。紫外—可見光譜(UV—Vis)表明HRP在

3、修飾膜里保持了它的天然構象。X—射線衍射(XRD)結果說明在修飾膜變干的過程中，HRP、AuCS和Clay之間發(fā)生了一個相互穿插—脫落—重新堆疊的過程。在0.1 M pH7.0的磷酸緩沖溶液中，HRP在—0.195 V顯示一對準可逆的氧化還原峰。該修飾電極用于檢測H2O2時電流響應快速，線性范圍是39μM—3.1 mM，檢出限是9μM。動力學參數(shù)，如電荷轉移系數(shù)、電子轉移速率常數(shù)和米氏常數(shù)分別為0.53、2.95±0.20 s-1和23

4、.15 mM。 3.實現(xiàn)了肌紅蛋白(Mb)在Clay/AuCS修飾電極上的直接電化學和生物催化作用。Mb被固定在Clay/AuCS修飾的玻碳電極和外層的粘土保護層之間。使用電化學方法、UV—Vis和XRD對該修飾體系進行了表征。在該修飾體系里，Mb的XRD結果與HRP的完全不同，說明蛋白質所帶的凈電荷能通過影響修飾膜中各層物質之間的相互作用，從而使粘土的基面間距發(fā)生變化。通過對H2O2和NaNO2的還原，考察了Mb在該修飾電極上

5、的生物催化活性。 4.建立了血紅蛋白(Hb)去折疊的模型。通過考察heme FeⅢ/FeⅡ的電化學響應，研究了尿素和/或pH誘導Hb去折疊的構象變化。此外，使用光譜技術進一步進行表征。結果表明，酸對Hb構象的影響明顯大于堿和濃尿素：當使用尿素或者強堿變性時，Hb被去折疊但heme—咪唑連接鍵沒有斷開；然而，當使用強酸(pH<4)變性時，heme—咪唑鍵斷裂。通過建立的熱力學循環(huán)證明，用尿素誘導去折疊時，還原態(tài)Hb的穩(wěn)定性明顯高于

6、氧化態(tài)Hb。通過優(yōu)化變性條件來控制Hb的去折疊態(tài)，從而使Hb的過氧化物酶活性增強了約18倍。光譜和電化學的結果高度吻合。表明電化學方法也能成為一個靈敏的手段用于蛋白質去折疊的研究。 5.建立了定量分析牛血清蛋白(BSA)的電化學方法。在pH5.0的HAc—NaAc緩沖溶液中，使用電化學方法研究了BSA和ARS的相互作用，并闡明了BSA和茜素紅S(ARS)的結合機理和結合位點。ARS和BSA主要通過疏水作用和氫鍵作用力形成了非電活