生物柴油基因工程菌的構(gòu)建及釀酒酵母產(chǎn)油脂條件研究.pdf

1、生物柴油是目前研究的熱點(diǎn)，其生產(chǎn)方法是將原料脂肪和甲醇或乙醇在化學(xué)催化劑或生物催化劑的催化下，轉(zhuǎn)化合成生物柴油。目前生物柴油的生產(chǎn)最少需要兩步：油脂的獲得和將油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油。如果能將這兩步集成在同一個生物體系中，將會大大縮短步驟，提高生物柴油的轉(zhuǎn)化效率。
　　 通過構(gòu)建生物柴油基因工程菌，將生物柴油專用脂肪酶的基因在酵母中表達(dá)，有可能直接把酵母合成的油脂和乙醇在重組體系產(chǎn)生的脂肪酶催化下合成脂肪酸乙酯，從而獲得一種高效的生物

2、柴油生產(chǎn)新技術(shù)。
　　 本文克隆了假絲酵母脂肪酶的成熟肽基因Lip2，同時克隆了釀酒酵母的強(qiáng)啟動子PGK1和終止子CYC1，構(gòu)建了兩個重組表達(dá)載體pYES2-Lip2和YEp352-PLC，使得脂肪酶基因在釀酒酵母(Saccharomycescerevsiae)中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)；同時，本文利用響應(yīng)面法對釀酒酵母產(chǎn)油脂條件進(jìn)行了優(yōu)化。
　　 本文對此設(shè)想進(jìn)行了如下主要工作：
　　 1、以假絲酵母(Candida sp

3、.99-125)基因組為模板PCR擴(kuò)增得到大小為903bp的目的基因片段Lip2，經(jīng)A-T克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證及序列測定，測定結(jié)果與報道完全一致；Lip2基因片段經(jīng)過雙酶切處理后插入到pYES2質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pYES2-Lip2，經(jīng)過半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)后，由SDS-PAGE鑒定表明，目的蛋白在胞內(nèi)有表達(dá)，而在胞外基本沒有表達(dá)。但是酶活檢測結(jié)果表明，胞內(nèi)目的蛋白基本上沒有活性。
　　 2、以

4、釀酒酵母(Saccharomyces cerevsiae)基因組為模板PCR擴(kuò)增得到大小為781bp的啟動子基因片段PGK1，以質(zhì)粒pYES2為模板PCR擴(kuò)增得到大小為260bp的終止子基因片段CYC1，經(jīng)A-T克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證及序列測定，測定結(jié)果與報道完全一致；通過重疊PCR法把Lip2基因與CYC1基因融合后，然后把經(jīng)過酶切處理后的PGK1基因和融合基因插入到Y(jié)Ep352質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體

5、YEp352-PLC，由SDS-PAGE鑒定表明，目的蛋白在胞內(nèi)有表達(dá)，而在胞外基本沒有表達(dá)。酶活檢測結(jié)果表明，胞內(nèi)目的蛋白具有1.3U/mL左右的酶活。
　　 3、運(yùn)用響應(yīng)面法對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)產(chǎn)油脂以及發(fā)酵條件優(yōu)化進(jìn)行了研究。首先根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Plackett-Burman設(shè)計對影響其產(chǎn)油脂相關(guān)因素進(jìn)行評估并篩選出具有顯著效應(yīng)的3個因素：檸檬酸，CaCl2和初始pH值。接

6、著用最陡爬坡試驗(yàn)逼近以上3個因子的最大響應(yīng)區(qū)域后，采用Box-Behnken設(shè)計以及響應(yīng)面分析法，確定其優(yōu)化后發(fā)酵條件為(w/v)：葡萄糖15％，蛋白胨0.2％，酵母浸粉0.4％，檸檬酸0.471％，MgSO4·7H2O0.1％,ZnSO4·7H2O0.2％,CaCl20.025％，F(xiàn)eSO4·7H2O0.005％，初始pH值為6.74，180 r/min，30℃培養(yǎng)96h。優(yōu)化后的油脂產(chǎn)率(干重)達(dá)到14.55％，比在種子培養(yǎng)基中油脂