L-苯丙氨酸基因工程菌的構建及其發(fā)酵條件研究.pdf

1、苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)在醫(yī)學、食品加工及飼養(yǎng)添加劑領域均有廣泛應用,目前國內企業(yè)的供應量遠不能滿足市場口益增長的需求量。因此,應用代謝上程的方法構建L-苯丙氨酸高產菌株,降低生產成本,對減少我國L-苯丙氨酸進口,提高市場競爭力具有重要意義。
　　 選取大腸桿菌L-苯丙氨酸合成路徑上的關鍵酶甘油激酶(glpK基因編碼)和3-磷酸甘油脫氫酶(glpD基因編碼),PCR克隆glpK與glpD基因后,將它們分別與

2、載體pAF(C)、pZA31連接,得到載體pAF(C)D、pAF(C)K I、p31K;然后分別改變載體pAF(C)K I的啟動子序列和基因glpK基因的核糖體結合位點序列(RBS序列)獲得載體pAF(L)K與pAF(C)KⅡ。將一個或兩個載體轉化入E.coll1MG△中,構建工程菌E.coli MG△pAF(C)D、E.coliMG△pAF(C)KⅠ、E.coliMG△pAF(L)KⅠ、E.coliMG△pAF(C)KⅡ、E.coli

3、MG△p31K-pAF(C)、E.coliMG△pAF(C)KⅡ-p31PT,首次實現(xiàn)了基因glpK與pheA和aroF,基因glpD與pheA和aroF,glpK與pheA、aroF、ppsA和tktA的共表達。
　　 將構建的工程菌做SDS-PAGE電泳,glpK和glpD基因在相應工程菌中均有表達,即在蛋白電泳凝膠上預期位置56.231 KD處(glpK)和56.751 KD處(glpD)有表達條帶。
　　 工程菌

4、在250 ml的燒瓶中,37℃、240 rpm/min條件下,分別以15 g/L葡萄糖和10 g/L甘油為碳源進行發(fā)酵,結果顯示,工程菌在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸產量顯著高于以葡萄糖為碳源時的產量,菌株E.coliMG△pAF(C)KⅡ的L-Phe產生能力較強。以10 g/L甘油為碳源發(fā)酵48 h后,工程菌E.coliMG△pAF(C)KⅡ的L-苯丙氨酸產量達到3.43 g/L,是同條件下對照菌株E.coliMG△pAF(C)

5、產酸量的3.33倍,是空白菌株E.coliMG△L-Phe產量的62.36倍,說明glpK基閃的表達達到了增加終產物L-Phe的目的。
　　 以E.coliMG△pAF(C)KⅡ為研究對象,進一步的發(fā)酵條件優(yōu)化后,結果顯示,大腸桿菌最適生長溫度37℃條件下,增加發(fā)酵時問、增加發(fā)酵過程中的通氣量有利于工程菌L-Phe的產出:在37℃、240 rpm/min條件下,E.coliMG△pAF(C)KⅡ在500 ml搖瓶中發(fā)酵48 h后