L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件研究.pdf

1、苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)在醫(yī)學(xué)、食品加工及飼養(yǎng)添加劑領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用,目前國內(nèi)企業(yè)的供應(yīng)量遠(yuǎn)不能滿足市場口益增長的需求量。因此,應(yīng)用代謝上程的方法構(gòu)建L-苯丙氨酸高產(chǎn)菌株,降低生產(chǎn)成本,對減少我國L-苯丙氨酸進(jìn)口,提高市場競爭力具有重要意義。
　　 選取大腸桿菌L-苯丙氨酸合成路徑上的關(guān)鍵酶甘油激酶(glpK基因編碼)和3-磷酸甘油脫氫酶(glpD基因編碼),PCR克隆glpK與glpD基因后,將它們分別與

2、載體pAF(C)、pZA31連接,得到載體pAF(C)D、pAF(C)K I、p31K;然后分別改變載體pAF(C)K I的啟動子序列和基因glpK基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列(RBS序列)獲得載體pAF(L)K與pAF(C)KⅡ。將一個或兩個載體轉(zhuǎn)化入E.coll1MG△中,構(gòu)建工程菌E.coli MG△pAF(C)D、E.coliMG△pAF(C)KⅠ、E.coliMG△pAF(L)KⅠ、E.coliMG△pAF(C)KⅡ、E.coli

3、MG△p31K-pAF(C)、E.coliMG△pAF(C)KⅡ-p31PT,首次實(shí)現(xiàn)了基因glpK與pheA和aroF,基因glpD與pheA和aroF,glpK與pheA、aroF、ppsA和tktA的共表達(dá)。
　　 將構(gòu)建的工程菌做SDS-PAGE電泳,glpK和glpD基因在相應(yīng)工程菌中均有表達(dá),即在蛋白電泳凝膠上預(yù)期位置56.231 KD處(glpK)和56.751 KD處(glpD)有表達(dá)條帶。
　　 工程菌

4、在250 ml的燒瓶中,37℃、240 rpm/min條件下,分別以15 g/L葡萄糖和10 g/L甘油為碳源進(jìn)行發(fā)酵,結(jié)果顯示,工程菌在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸產(chǎn)量顯著高于以葡萄糖為碳源時的產(chǎn)量,菌株E.coliMG△pAF(C)KⅡ的L-Phe產(chǎn)生能力較強(qiáng)。以10 g/L甘油為碳源發(fā)酵48 h后,工程菌E.coliMG△pAF(C)KⅡ的L-苯丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到3.43 g/L,是同條件下對照菌株E.coliMG△pAF(C)

5、產(chǎn)酸量的3.33倍,是空白菌株E.coliMG△L-Phe產(chǎn)量的62.36倍,說明glpK基閃的表達(dá)達(dá)到了增加終產(chǎn)物L(fēng)-Phe的目的。
　　 以E.coliMG△pAF(C)KⅡ?yàn)檠芯繉ο?進(jìn)一步的發(fā)酵條件優(yōu)化后,結(jié)果顯示,大腸桿菌最適生長溫度37℃條件下,增加發(fā)酵時問、增加發(fā)酵過程中的通氣量有利于工程菌L-Phe的產(chǎn)出:在37℃、240 rpm/min條件下,E.coliMG△pAF(C)KⅡ在500 ml搖瓶中發(fā)酵48 h后