產(chǎn)奎尼酸基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文產(chǎn)奎尼酸基因工程菌的構(gòu)建姓名：陳梅芳申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)和分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：徐琪壽20030520! 主竺查 苧查苧苧C o n s t r u c t i o n o f B i o e n g i n e e r i n g s t r a i nP r o d u c i n g Q u i n i ca c i dA b s t r a c tQ u i n i ca c i

2、 d i s o n eo fa r o m a t i cs m a l lc o m p o u n d s ，i th a sw i d e l yb e e nu s e da st h ei m p o r t a n t r a w m a t e f i a li nt h ef i e l d so f m e d i c i n e ，f o o da n d c h e m i c a li n d u s t r

3、y , M e t a b o l i ce n g i n e e r i n gw a si n t r o d u c e di nt h es t u d i e so f r e c o m b i n a n tE c o l ic o n s t r u c t st op r o d u c eq u i n i ca c i d ．P r o d u c t i o no f a n e w m e t a b o l

4、 i t e ，i ．e ．q u i n i ca c i d ，u s e ds h i k i m a t e p a t h w a yi nE c o l i ,i t i s n e c e s s a r yt o e x t e n dm e t a b o l i cp a t h w a yb yi n t r o d u c t i o no fah e t e r o g e n o u sg e n eq u

5、t Bi n t ot h eh o s tc e l l ．D o u b l es p e c i f i ce n z y m eg e n e sa r o Gq u t Bo rt h r e eo n e sa r o Gq u t B ，a r o Bw e r ec o —e x p r e s s e di na s i n g l ep l a s m i d p B V 2 2 0 t oi m p r o v e

6、t h ee n z y m e s ’r a t e —l i m i t i n gr e a c t i o n s ．M o d i f i c a t i o n so f E c o l fc h r o m o s o m e b y b o t hd i s r u p t i o no f t h ea r o Dg e n ea n d d i r e c t e d - s i t ei n s e r t i o

7、 no f t h ea r o Bg e n er e s u l t e di nt h ec h a n g eo f c a r b o nf l o w r e d i r e c t e di n t ot h eq u i n i c a c i db i o s y n t h e s i sb r a n c h ．1 ．O v e r e x p r e s s i o n o f t h e r a t e - l

8、 i m i t i n ge n z y m e g e n e s o f E ．c o l iS t r a i nE c o l i W 3 1 1 0 c h r o m o s o m eD N A a n d p l a s m i dp G 9 0 8 D N A w e r es e p a r a t e l yu s e d a st e m p l a t e t oa m p l f y g e n e sa

9、r o Ba n da r o G b y P C R ，t h eD N A s e q u e n c i n gs h o w e dt h a tt h ec l o n e dg e n e s w e r ei na g r e e m e n t w i t ht h er e p o r t e ds e q u e n c e s ．E a c ho f t h et w og e n e sw a s o v e r

10、 e x p r e s s e d b yh i 曲一e f f i c i e n te x p r e s s i v ev e c t o rp B V 2 2 0 ，a n d t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo f D S w a s b e t t e r ．2 ．C l o n i n ga n df u n c t i o n a le x p r e s s i o no f

11、ah e t e r o g e n o u sg e n ef r o m A ．n i d u l a n si nE c o l iS t r a i n A ．n i d u l a n sc h r o m o s o m e D N A w a s u s e d a st e m p l a t e t oa m p l f y g e n eq u t B b yP C R ，t h eD N A s e q u e n

12、 c i n gs h o w e dt h a t t h ec l o n e dg e n ew a si n a g r e e m e n tw i t ht h er e p o r t e ds e q u e n c e ．T h eg e n eq u t B w a s c l o n e d t op B V 2 2 0 ，Q D H a s e w a s e x p r e s s e da n dh a d

13、s p e c i f i ca c t i v i t yi n E ．c o l i ．3 ．C o n s t r u c t i o n o fc o - e x p r e s s i o n r e e o m b i n a n t so fm u l t i g e n e si n a s i n g l ep l a s m i dp B V 2 2 0 a n d i t so p t i m i z a t i

14、o nA c c o r d i n gt o d i f i e r e n t c o m b i n e dm o d e s ，s i xc o —e x p r e s s i o n r e c o m b i n a n t s ．e a c hg e n eo f w h i c hr e c o m b i n a n ti su n d e rc o n t r 0 1o f L m n b d a p h a s

15、eP R P L o rP L p r o m o t e r ,w e r ec o n s t r u c t e da n de x p r e s s e d ．F o u ro f t h es i xr e s u l t i n gr e c o m b i n a n t sc o n t a i n e dt w og e n e s a r o Ga n dq u t B ，t h e o t h e r c o n

16、 t a i n e dt h r e e g e n e s a r o G q u t Ba n d a r o B ．T h ec a t a l y t i ca c t i v i t i e so f b o t hD S a n dQ D H a s e i n c r e a s e dd i f f i e r e n t l y , b u te n z y m e a c t i v i t i e so f t

17、h e r e c o m b i n a n t h a r b o r i n g p B V - P R P L ．q u t B ．P L —a r o G w e r e b e s t ．4 ．E n g i n e e r i n gD H Q a s e ( a r o D ) ·d e f i c i e n tE ．c o l i m u t a n tw i t has e c o n dc o p yo

18、 ft h ea r o B g e n eG e n e t a r g e t i n gt e c h n i q u e w a s u s e d t od i s r u p tt h ea r o D g e n e i nE ．c o l ic h r o m o s o m e ．T h e m u t a n t 3 1 B Kw a s e n g i n e e r e d ，i n w h i c h h o

19、m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n o ft h ea r o B K a n r g e n e c a s s e t t e i n t o t h e a r o D l o c u s ( a r o D ：：a r o B K a n l ) o f t h e E c o l i s t r a i nA T C C 3 18 8 4g e n o m e u t i l i