三聚氰胺酶聯(lián)免疫分析方法的研究.pdf

1、針對三聚氰胺污染及違法添加問題，本論文對三聚氰胺的酶聯(lián)免疫分析方法開展了研究。
　　本研究首次用雙胍和氯乙酸乙酯在甲醇鈉條件下制備6-氯甲基-1，3，5-三嗪-2，4-二氨基，6-氯甲基-1，3，5-三嗪-2，4-二氨基與3-巰基丙酸反應(yīng)合成三聚氰胺半抗原3-((4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-基)-甲硫基）丙酸。采用活化酯法將半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)制備免疫原，免疫新西蘭大白兔獲得了高效價的抗血清，抗血清效價約200000。

2、抗血清采用ProteinA-Sepharose4B親合層析法純化。采用活化酯法將半抗原與牛血清蛋白偶聯(lián)制備包被原，與辣根過氧化氫酶偶聯(lián)制備酶標(biāo)抗原。經(jīng)過優(yōu)化確定間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的最佳工作條件，包被原的包被量為0.005μg/孔、抗體稀釋倍數(shù)為1∶4000、封閉液為0.5％脫脂乳粉/PBS，方法對三聚氰胺的檢測靈敏度(IC50)為45.45±2.62ng/mL，檢測限(IC15)為2.72±0.18ng/mL。經(jīng)過優(yōu)化確定直接競爭

3、酶聯(lián)免疫檢測方法的最佳工作條件，抗體包被量為1.0μg/孔、酶標(biāo)稀釋倍數(shù)為1∶800、封閉液選用0.5％脫脂乳粉/PBS，建立直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，方法對三聚氰胺的檢測靈敏度(IC50)為7.8±1.3ng/mL，檢測限(IC15)為0.66±0.18ng/mL。除對環(huán)丙氨嗪有交叉反應(yīng)外，對其他三嗪類物質(zhì)幾乎沒有交叉，說明抗體具有很好的特異性。
　　選擇牛奶、奶粉及其他乳制品作為樣品進(jìn)行添加回收實驗，牛奶的回收率為79.3％-

4、93.6％之間，奶粉的回收率為94.1％到113.2％之間，二者的變異系數(shù)(n=3)均小于20％。使用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜方法驗證本實驗建立的直接競爭酶聯(lián)免疫方法，兩種方法檢測的結(jié)果具有較高的一致性，線性回歸方程為y=0.8266x+20.791，相關(guān)性系數(shù)R2=0.968，表明所建立的直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法具有很好的準(zhǔn)確性和精密度。
　　本研究建立的直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法靈敏度高，特異性好，準(zhǔn)確度好，樣品前處理簡單，適合多種