三螺旋電致化學發(fā)光生物傳感器的研制及應用.pdf

1、三螺旋DNA是在雙螺旋DNA的基礎上形成的，三螺旋結(jié)構在研發(fā)新的生物分子工具以及治療試劑等方面具有巨大的潛力，可以對特定序列的雙鏈DNA予以識別，以及對基因調(diào)節(jié)，包括干擾基因轉(zhuǎn)錄、復制和重組。三螺旋DNA的研究有助于深入理解細胞過程，揭示某些基因疾病的形成機理，為建立基因疾病新療法提供全新的思路。
　　 本論文以適體探針作為蛋白質(zhì)與小分子的特異識別分子，結(jié)合具有靈敏的信號轉(zhuǎn)換功能的電致化學發(fā)光技術，與三螺旋DNA雜交技術相結(jié)合，

2、通過對DNA序列的設計來選擇性的識別和檢測凝血酶、腺苷的濃度，設計簡單靈活，為蛋白質(zhì)和小分子的研究提供了新的手段和思路。本論文主要內(nèi)容包括以下三個方面：
　　 1研究了一種新穎的基于二茂鐵猝滅聯(lián)吡啶釘發(fā)光的三螺旋電致化學發(fā)光(ECL)生物傳感器，首先將標記聯(lián)吡啶釘?shù)腄NA自組裝到金電極上，然后與特定序列的DNA、標記二茂鐵羧酸的DNA，在綁定劑存在的條件下雜交，形成三螺旋DNA結(jié)構。然后對合成的發(fā)光標記物的濃度進行了標定，以及對

3、探針溶液進行了表征，和對綁定劑進行了選擇，初步形成了一種可行的三螺旋DNA生物傳感器，為接下來的凝血酶和腺苷的檢測提供了一種可行的方法。
　　 2在前期工作的基礎了，我們改進了實驗方法，研究了一種以適體為基礎的ECL-三螺旋DNA生物傳感器，使之用于凝血酶濃度的檢測。在凝血酶存在下，DNA-3中凝血酶的適體部分與凝血酶結(jié)合，標有二茂鐵的DNA-3被解離下來，茂鐵基團遠離聯(lián)吡啶釕基團，從而使聯(lián)吡啶釘發(fā)光強度增強，以發(fā)光強度的變化值

4、為信號實現(xiàn)了對凝血酶濃度的高靈敏度的檢測。凝血酶濃度的線性范圍是是4.0×10-15～3.0×10-14molL-1，檢測限可達1.0fmolL-1。同時，設計了雙螺旋檢測凝血酶的對比試驗，實驗結(jié)果顯示，我們的三螺旋生物傳感器比其靈敏度提高了100倍。本方法對提高蛋白質(zhì)檢測的特異性與靈敏度提供了一條有效的途徑。
　　 3在以上兩種DNA傳感器的研究基礎上，我們探索了第三種傳感器，將標記聯(lián)吡啶釘?shù)南佘者m體鏈固定到金電極表面，選擇三

5、螺旋特征鏈和標記二茂鐵基團的DNA鏈與之互補，形成三螺旋結(jié)構，在腺苷的作用下，聯(lián)吡啶釘標記的探針與腺苷結(jié)合，形成腺苷-適體的發(fā)夾式復合結(jié)構，從而聯(lián)吡啶釕更接近于電極表面而遠離二茂鐵，使發(fā)光強度大大增強。以發(fā)光強度的變化值為信號對腺苷的濃度進行檢測，在最佳條件下，腺苷濃度的線性范圍是1.0×10-9～1.0×10-8molL-1，檢測限可達2.7×10-10molL-1。并進行了雙螺旋對比試驗，三螺旋生物傳感器比雙螺旋的靈敏度提高了大約1