核酸探針電致化學發(fā)光生物傳感器檢測土壤中鉛離子的研究.pdf

1、重金屬離子具有生物毒性大、易被生物富集、難于自然降解等的特點，嚴重危害生態(tài)環(huán)境和人類生命健康，而傳統(tǒng)檢測方法多依賴大型儀器，存在檢測時間長，靈敏度相對較低等缺點，因此探索建立快速、靈敏、低成本的痕量重金屬分析檢測方法有重要意義。電致化學發(fā)光（ECL）結合了發(fā)光分析的高靈敏度和電化學分析的高可控性，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點，可顯著提高分析檢測靈敏度和選擇性，尤其適用于被測物濃度低，組分復雜，干擾物多的環(huán)境樣品。本文以土壤中P

2、b2+的檢測為研究模型，利用具有高選擇性的核酸探針為識別元件，從信號輸出模式、ECL體系、核酸放大技術等多方面著手，并進一步結合多種復合納米材料，設計構建了多種高靈敏ECL檢測Pb2+的新方法。研究結果為污染土壤 Pb2+的快速、靈敏的檢測提供了一個新的思路和方法，有利于提高Pb2+的檢測精度，在土壤、水環(huán)境分析實踐中具有十分重要的意義。
　　本研究主要內容包括：⑴結合目標物循環(huán)與雜交鏈式反應（HCR）信號放大策略構建了Pb2+E

3、CL生物傳感器。該傳感器可以通過 Pb2+和脫氧核酶（LC）的特異識別作用，并結合目標物循環(huán)和雜交鏈式（HCR）反應，在電極表面生成了大量由DNA雜交形成的長雙鏈聚合物。這些雙鏈聚合物可以通過靜電吸附作用固載ECL信號分子鄰菲羅啉釕配合物。利用固載在電極基底的聚乙烯亞胺還原的金納米顆粒對發(fā)光試劑的共反應作用顯著放大檢測信號，構建了對Pb2+的“signal on”響應模式ECL檢測新方法。實驗結果表明，在Pb2+濃度范圍為1×10-12

4、 mol/L~1×10-7 mol/L（2.07×10-10 g/L~2.07×10-5 g/L）之間，表現(xiàn)出良好的線性關系，其檢出限為3.33×10-13 mol/L(6.89×10-11 g/L)。將該方法用于土壤樣品中鉛離子的檢測，所得回收率介于98.7%~103%之間，說明該傳感器對Pb2+的檢測良好的準確度。⑵制備了多邊形的金納米顆粒（HIFAuNPs）作為固載基質，聚酰胺-胺型樹枝狀高分子 PAMAM既作為交聯(lián)分子又作為共反

5、應基團，通過酰胺反應將發(fā)光試劑羧基化聯(lián)吡啶釕 Ru-COOH與 PAMAM交聯(lián)到同一個分子內，制備了具有更高發(fā)光效率的自增強的ECL發(fā)光試劑作為ECL信標。另一方面，將 L-半胱氨酸（L-Cys）和金納米顆粒電沉積到電極上，增大了電極的比表面積，用以固定大量端基為巰基的輔助探針（APs），同時L-Cys與Ru-COOH通過分子間共反應增強了ECL信號，從而實現(xiàn)了分子間和分子內共反應雙重信號放大策略。當Pb2+存在時，Pb2+與固載到電極

6、界面的捕獲探針（Cps）形成了穩(wěn)定的G-四鏈體，誘導雙鏈DNA釋放CPs。電極上的APs進一步捕獲信標產生ECL信號，Pb2+濃度越大，ECL響應越強。實驗結果表明，該方法具有較好的選擇性和穩(wěn)定性，其線性范圍為1.0×10-13 mol/L~1.0×10-7 mol/L(2.07×10-11 g/L~2.07×10-5 g/L)，檢出限為3.33×10-14 mol/L(6.89×10-12 g/L)。用ECL適體傳感器和傳統(tǒng)的石墨爐原

7、子吸收光譜法（GF-AAS）對相同的土壤樣品進行檢測，兩種方法之間具有較好的一致性，證明該傳感器在檢測環(huán)境土壤中痕量的Pb2+很有應用潛力。⑶制備了分子內自增強ECL分子PAMAM-Ru作為發(fā)光物質直接標記對鉛離子有特異識別作用的脫氧核酶8-17 DNAzyme的底物鏈。該分子通過分子內的相互作用及快速電子傳遞，極大地提高了ECL試劑的發(fā)光效率及穩(wěn)定性。另一方面，制備了納米金功能化的石墨烯和C60的復合物（Au@rGO-C60），利用該

8、納米復合材料自身的大比表面積固載大量的8-17 DNAzyme使其與底物鏈結合形成Pb2+特異剪切位點，同時由于其自身具有促進電子傳遞作用進一步放大響應信號。當測試溶液中含有S2O82-作為分子間共反應試劑時，與PAMAM分子內自增強作用相結合實現(xiàn)雙重信號放大，獲得較強的初始信號。當 Pb2+存在時，識別特異的剪切位點，從而使結合到電極表面的PAMAM-Ru離開電極，ECL信號顯著降低，構建了“signal off”型ECL鉛離子傳感器

9、。其檢測范圍為1.0×10-15 mol/L~1.0×10-8 mol/L(2.07×10-13 g/L~2.07×10-6 g/L)，檢測限為3.33×10-16 mol/L(6.89×10-14 g/L)。將制備的傳感器用于實際土壤樣品中Pb2+的檢測，并采用標準加入法對傳感器回收率進行了測定，所得回收率介于96.2%~103%之間，說明傳感器具有較好的實際應用價值。⑷以C60作為新型碳源，利用強酸氧化法加熱回流合成法制得碳量子點（

10、CQDs）為ECL發(fā)光試劑，并通過交聯(lián)作用將CQDs固載到氨基功能化的石墨烯納米材料表面?；趬A基的互補配對原則在電極表面引入標記了金納米粒子的鉛離子適體探針互補鏈（CDNA），以增強適體傳感器的ECL響應，制得Pb2+適體傳感器。當有目標物 Pb2+存在時，Pb2+與其適體鏈形成 G四鏈體結構，釋放出金納米粒子標記的增強探針，從而使得 ECL信號減小。該傳感器的檢測范圍為1.0×10-13 mol/L~1.0×10-3 mol/L(2

11、.07×10-11 g/L~2.07×10-1 g/L)，檢測限為3.3×10-11 mol/L(6.89×10-12 g/L)。該ECL適體傳感器對實際土壤樣品中的Pb2+進行檢測，其回收率在98.8-105%。⑸利用“signal on-off-on”型檢測模式構建超靈敏 ECL鉛離子傳感器。首先利用金納米粒子的促進電子傳遞作用得到S2O82-的超高信號作為初始“signal-on”信號。接著利用線性滾環(huán)擴增反應得到一條與環(huán)形DNA

12、模板互補的具有大量G堿基的酶鏈序列，使之與氯化血紅素結合形成 hemin/G-四鏈體結構，它的存在導致 S2O82-電致化學發(fā)光猝滅，得到較低 ECL信號的“signal-off”的狀態(tài)。而當體系中出現(xiàn)Pb2+時，Pb2+剪切掉互補底物鏈探針，進而使hemin/G-四鏈體離開電極表面，從而引起ECL信號的恢復。因此“on-off-on”檢測最終信號與目標物 Pb2+的濃度成正比，可以得到超靈敏的 Pb2+傳感器。該傳感器的線性響應范圍為