黑曲霉木聚糖酶的同源表達、發(fā)酵及其酶學性質研究.pdf

1、木聚糖酶作為一種重要的食品、飼料等領域的工業(yè)酶制劑,成為研究的熱點，為了提高其產量，有100多個木聚糖酶基因被克隆，且均表達在大腸桿菌和酵母等異源宿主內。本研究以絲狀真菌黑曲霉A327為出發(fā)菌，采用同源表達策略對從中克隆的xynB基因進行了高效表達。結果如下：
　　1.木聚糖酶基因和上游調控區(qū)序列克隆及其分析
　　以黑曲霉A327總DNA為模板，根據GenBank中xynB基因全序列設計引物，有效地擴增了木聚糖酶的結構基因及

2、其5'端序列片段，并進行TA克隆和DNA序列測定。測定的目的片段大小為1611bp，其中結構基因長744bp，含一個長66bp的內含子，編碼的氨基酸長度為225個aa，與GenBank中不同曲霉的木聚糖酶氨基酸序列進行比較，發(fā)現(xiàn)與黑曲霉（登錄號：AY126481.1）的同源性最高為99.56％、其次為宇佐美曲霉98%；且xynB屬于G/11族木聚糖酶。序列分析表明，所克隆的5'端非編碼序列含有真核生物啟動子轉錄起始位點，及真核基因表達調

3、控核心元件“TATA”box及“CCAAT”box。
　　2.木聚糖酶基因表達載體的構建及其表達
　　通過基因克隆技術，利用pBS-T載體、黑曲霉 A327自身的啟動子和xynB基因、構巢曲霉的終止子和選擇標記基因amds，構建表達質粒pBS-XTP，轉化A327后，獲得上百個轉化子，搖瓶篩選了其中的96個，發(fā)現(xiàn)87.5%的轉化子產酶活力較對照高。通過PCR擴增鑒定部分轉化子，均檢測到了表達載體上的選擇標記基因amds上長度

4、為1.8kb的片段,證明為陽性表達；將酶活較高的8個轉化子平板分離后搖瓶發(fā)酵驗證產酶水平，發(fā)現(xiàn)70＃菌株產酶活力最高。對部分轉化子和A327發(fā)酵產物進行SDS-PAGE電泳分析，與液體發(fā)酵酶活測定的結果一致。
　　3.高表達基因工程菌的發(fā)酵特性研究
　　在優(yōu)化碳源、氮源等營養(yǎng)條件的基礎上，設計了L9（43）的正交實驗，并優(yōu)化了發(fā)酵條件，得到轉化株70＃產木聚糖酶的優(yōu)化培養(yǎng)基配方(g/L)和產酶適宜條件：玉米芯80，麩皮18,

5、糖蜜14，NaNO38，發(fā)酵溫度以28～31℃為佳，接種量以5％為宜,溶氧對菌株產酶影響很大：裝液量30mL/100mL三角瓶、搖床轉速230rpm時，產酶活力較大。在上述條件下研究其發(fā)酵特性，發(fā)酵周期72h，產酶活力較對照菌株提高近30倍，達6102IU/mL。
　　4.木聚糖酶的分離純化和酶學性質研究
　　粗酶液經硫酸銨分級沉淀、透析和DEAE Sepharose陰離子交換層析得到一種電泳純的單一組分木聚糖酶，相對分子質

6、量約為21KDa。該酶的最適 pH值和最適溫度分別為pH5.2和55℃，在4～10的pH范圍內能保持90%以上的酶活，在35℃～45℃溫浴40min酶活力保持在100%以上，以樺木木聚糖為底物的酶動力學常數(shù) Km值和Vmax分別為6.17mg/mL和3020mmol/(min·mg)。金屬離子Zn2+和Na+對酶活有促進作用，其它離子對木聚糖酶的活性有抑制作用，F(xiàn)e3+對酶活的抑制作用最強；酶對燕麥木聚糖的底物特異性較樺木木聚糖高1.6