黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶條件優(yōu)化及xynB基因的克隆、表達(dá).pdf

1、木聚糖是半纖維素的主要成分，是自然界除纖維素以外含量最多的多糖類物質(zhì)。木聚糖酶是可以將木聚糖降解成木寡糖和木糖的一組酶的總稱，廣泛應(yīng)用于飼料、食品、造紙，乙醇生產(chǎn)等方面。
　　 本研究選用黑曲霉(CICC40616)作為研究材料。利用單因素實驗確定黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶最優(yōu)碳源為木聚糖，最優(yōu)氮源為酵母膏，培養(yǎng)基最優(yōu)初始pH為4.0，最優(yōu)碳酸鈣含量為1％。通過三因素三水平正交實驗，確定黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶最優(yōu)條件:1％木聚糖，1％豆粕粉，培

2、養(yǎng)溫度33℃，優(yōu)化后產(chǎn)酶量提高了71.2％。
　　 本研究克隆了黑曲霉xynB基因并在釀酒酵母INVSC1中進(jìn)行異源表達(dá)。結(jié)果顯示，xynB基因在釀酒酵母中成功表達(dá)。與釀酒酵母α信號肽相比，木聚糖酶B自身信號肽能夠更加有效地引導(dǎo)木聚糖酶B分泌到胞外。含有木聚糖酶B自身信號肽的重組釀酒酵母pYES2-xynB在誘導(dǎo)48 h后，木聚糖酶產(chǎn)量為6.71 U/mL，誘導(dǎo)72 h后，酶產(chǎn)量達(dá)到最高，為7.59 U/mL;含有α信號肽的重組

3、釀酒酵母pYES2-xynB-α在誘導(dǎo)48 h后，酶活達(dá)到最高，為3.97 U/mL，誘導(dǎo)72 h后，酶產(chǎn)量降低至3.47 U/mL。通過硫酸銨鹽析、超濾、鎳離子金屬螯合親和層析等方法對重組木聚糖酶B進(jìn)行純化。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，重組木聚糖酶B相對分子質(zhì)量約為23 kDa。重組木聚糖酶B的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH分別為50℃，pH5.0。重組酶在40℃孵育30 min，酶活幾乎沒有損失，50℃時酶活幾乎損失

4、一半，60℃時酶活完全喪失。重組酶在pH3～11的緩沖液中非常穩(wěn)定，孵育3h，酶活幾乎沒有損失。Ca2+、Mn2+、Zn2+對木聚糖酶B具有一定的抑制作用，其中Mn2+的抑制作用最強(qiáng)，使酶活降低約30％，Cu2+具有一定的激活作用，可使木聚糖酶B活力提高7.9％，F(xiàn)e2+、Ni2+、Co2+、Mg2+對木聚糖酶B活力沒有顯著的作用。以櫸木木聚糖作為底物時，重組木聚糖酶BKm值為11.25 mg/mL，比活力為9110 U/mg，Vmax