木聚糖酶的酶學特性及基因克隆表達研究.pdf

1、木聚糖(xylan)是一種多聚五碳糖，是植物半纖維素的重要組分，它占植物碳水化合物總量的三分之一，在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生生物資源。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱。它可以將木聚糖降解為寡聚木糖、木糖和少量單糖。它在飼料、造紙、食品、制藥以及能源工業(yè)中均有著廣泛的應用。本論文主要對黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶進行了如下研究： 1.黑曲霉培養(yǎng)基的優(yōu)化。通過單因素試驗及正交試驗確定了黑曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)木聚

2、糖酶最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：麩皮80g/L，酵母膏15g/L，Tween802g/L，無機鹽K2HPO4為2.6％，CaCl2為0.5％，MgSO4.7H2O為1％，F(xiàn)eSO4.7H2O為0.016％，裝液量為50 ml/250 ml，培養(yǎng)的起始pH為5.0，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為72 h，搖床的轉速為150r/min，在此條件下，菌株產(chǎn)木聚糖酶活性較高，能提高至酶活為85.3U/ml。 2.用雙水相法提純木聚糖酶。本文利用

3、雙水相法對木聚糖酶粗酶進行提純，確定最佳的純化條件為：PEG4000濃度為19％(w/w)、磷酸氫二鉀濃度為10％(w/w)、氯化鈉濃度為0(w/w)。在此條件下，木聚糖酶的提取效果較好，K和Yt的值分別為29.34和88.67％。 3.木聚糖酶酶學性質的研究。本論文對黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的酶學性質進行了研究，結果表明：該木聚糖酶的最適反應溫度為50℃，最適pH為5.0，在酸性的條件pH3.0～6.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，是典型的酸性

4、木聚糖酶；在40～50℃間的熱穩(wěn)定性較好。在金屬離子中，F(xiàn)e2+、Mg2+、Zn2+對木聚糖酶的酶活有不同程度的促進作用：Al3+對木聚糖酶稍有影響使其活力降低；而其余的大部分金屬離子對酶的活性的影響并不大，并沒有發(fā)現(xiàn)對酶有著明顯激活或抑制作用的離子。 4.本論文以黑曲霉菌株基因組DNA和cDNA為模板，通過PCR擴增出得到一條大小約為750bp和680bp的片段，測序結果表明該DNA基因全長746bp，含有68bp的內(nèi)含子，基

5、因編碼區(qū)長678bp，目前，該基因已提交Gen Bank，登錄號為EU423881。。 將測序所得正確的xynB結構基因與酵母分泌型表達載體pPIC9K進行連接，轉化大腸桿菌DH-5α，構建表達載體pPIC9K-xynB。后用電擊轉化法將重組質粒轉化畢赤酵母(Pichia pastorisGS115)，經(jīng)MM/MD快慢斑進行篩選，并挑取數(shù)個慢斑進行甲醇誘導培養(yǎng)，4～6天后，將其點于RBB-木聚糖平板上，可見產(chǎn)生了明顯的透明圈。工

6、程菌SMD-xynB-2木聚糖酶產(chǎn)量達到216U/ml，比原出發(fā)菌株提高了2.53倍，表達產(chǎn)物具有生物學活性，分泌到細胞外，可溶且木聚糖酶的表達具有良好的遺傳穩(wěn)定性。重組木聚糖酶的酶學性質與原始木聚糖酶基本相同，分別為最佳反應溫度為50℃，最適pH約為5.0，熱穩(wěn)定性和原菌株相比，在40℃～70℃時變化不明顯，80℃比原菌株下降0.2％。探索了不同碳源、不同氮源及甲醇的添加量對重組酵母產(chǎn)木聚糖酶的影響，結果表明：最佳的碳源為麩皮，最佳的

7、氮源為牛肉膏，甲醇的添加量為0.5％誘導效果最好。SDS-PAGE電泳表明，重組酵母產(chǎn)木聚糖酶的分子量約為24KD。 5.以紫花苜蓿無菌苗的下胚軸、子葉、葉片和葉柄為外植體，研究了不同培養(yǎng)基、不同激素種類和配比對胚性愈傷組織誘導的影響，以及不同分化培養(yǎng)基對胚狀體分化的影響。結果表明：下胚軸外植體胚性愈傷組織誘導率最高；最佳胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基為改良SH+2.0mg/L2.4-D+0.5 mg/L6-BA；最佳胚狀體誘導培養(yǎng)基為