多壁碳納米管的表面化學修飾調(diào)控細胞自噬的研究.pdf

1、由于具有獨特的理化性質(zhì)，納米材料在航空航天、能源、建材、涂料、催化、環(huán)境保護、電子器件、生物醫(yī)藥以及消費品等領域有著廣泛的應用。與納米材料相關的產(chǎn)品正加速走進人們的日常生活。納米材料的廣泛應用加大了其與人體接觸并進入人體的幾率，因此研究納米材料的生物學效應，即其對基本生命過程的影響，從而更好地評價其生物安全性就顯得十分必要和緊迫。
　　自噬，意為自體吞噬，是利用溶酶體機制降解細胞內(nèi)物質(zhì)成分的過程的統(tǒng)稱。其廣泛存在于從低等的酵母菌到

2、高等的哺乳動物細胞等所有真核細胞中，是與泛素-蛋白酶體機制并列的另一種降解途徑。通常情況下，細胞保持低水平的基礎的自噬活性來應對代謝壓力、衰老或破損的細胞器、錯誤折疊或聚集的蛋白來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在如饑餓、能量缺乏等代謝脅迫的情況下，自噬會被上調(diào)，短期內(nèi)為細胞提供必要的營養(yǎng)和能量，應對生存壓力。而如果細胞長時間處于較高的自噬水平，就會引起自噬性細胞死亡。另外，越來越多的研究表明自噬過程的缺失或者紊亂與包括癌癥、神經(jīng)退行、Ⅱ型糖尿病

3、、粥樣動脈硬化等很多疾病的發(fā)生和發(fā)展都有密不可分的復雜關系。鑒于細胞自噬的復雜性，適當?shù)膶ψ允蛇M行調(diào)控，趨利避害，最大限度地利用它進行疾病的治療在近年來得到研究人員越來越多的關注。
　　納米材料作為一種新型的自噬誘導劑，其對自噬的影響越來越得到人們的關注。由于自噬本身在生物系統(tǒng)中作用的復雜性，納米材料與細胞自噬的關系也相應得存在著兩面性。一方面，許多納米材料可以誘導自噬，這就對原有的小分子自噬誘導劑形成了有益的補充;另一方面，納米

4、材料可能會干擾溶酶體功能造成自噬過程的阻滯，從而帶來細胞毒性，為納米材料的應用帶來不必要的副作用。因此通過適當?shù)氖侄螌{米材料進行修飾，從而可控地調(diào)節(jié)自噬的程度就顯得十分必要。
　　我們對包含MWCNT-COOH在內(nèi)的共81種具有不同表面修飾的MWCNT庫的細胞自噬誘發(fā)能力進行了評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同表面修飾分化了MWCNT的自噬誘發(fā)能力。通過量化自噬小體的個數(shù)，將81種不同表面修飾的MWCNT的自噬誘發(fā)能力分成了4類。包含羧基在內(nèi)的

5、7種多壁碳納米管具有極強的自噬誘導能力，而也有7種碳管因為適當?shù)匦揎椂鴨适Я俗允烧T導能力，其他碳管的自噬誘導能力則介于上述兩個級別之間，分別具有較弱或較強的自噬誘導級別。因此，表面修飾成功地分化了誘導自噬的能力，并且這種能力不局限于單一細胞性。我們還使用計算化學的手段PharmacophoreQuery對碳管表面分子結(jié)構(gòu)與自噬誘導能力之間進行了構(gòu)效關系的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胺基和羰基這兩種氫鍵受體及其相對位置是誘導自噬的關鍵基團。在具有最強自

6、噬誘導能力的三種碳管都含有這兩種基團，且它們都處于相同的平面內(nèi)，而在喪失自噬誘導能力的三種碳管中，上述兩種基團都發(fā)生了一定程度的位移，這可能是由于大的吸電子芳香環(huán)的引入造成的。這些發(fā)現(xiàn)為今后有目的地設計碳管表面配體，對自噬進行可控的調(diào)控提供了一定的理論基礎。
　　在分子層面研究小分子或納米材料誘發(fā)自噬的機制是當前自噬研究領域的前沿。我們使用免疫印跡的方法對強自噬誘導級別的碳管進行自噬通路mTOR的檢測后發(fā)現(xiàn)，7種最強自噬誘導級別的

7、碳管誘發(fā)自噬的通路也發(fā)生了分化。我們選取mTOR依賴的MWCNT-COOH和另一種與其自噬級別接近的mTOR非依賴的MWCNT41進行更深入的機制研究。電鏡是判斷自噬發(fā)生的金標準，TEM觀察到兩種碳管處理后的細胞中都有自噬小體的生成，且部分自噬小體內(nèi)還包裹有碳管，針對LC3B的免疫印跡實驗也表明，兩種碳管以劑量依賴的方式誘導HEK293細胞產(chǎn)生自噬。隨后我們排除了兩種碳管表面配體解離從而誘發(fā)自噬的可能。通過AnnexinV/7-AAD雙

8、染實驗及caspase3的免疫印跡實驗排除了兩種碳管誘導凋亡的可能性。采用具有熒光信號的FITC-BSA分子標記的碳管處理細胞，發(fā)現(xiàn)兩種碳管在多個時間點具有相似的細胞攝入量。使用Fluo-3AM鈣離子熒光探針檢測碳管處理后的細胞發(fā)現(xiàn)，兩種碳管在低濃度（25μg/mL）和高濃度（100μg/mL）時均沒有引起細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的改變，從而排除通路不同是由于二者對胞內(nèi)游離鈣離子濃度影響的不同帶來的。透射電鏡觀察到兩種碳管在細胞內(nèi)具有相似的

9、亞細胞定位，排除細胞定位不同造成的影響。自噬相關基因PCR陣列實驗顯示，兩種碳管在對IGF-1和IFNA2的表達上發(fā)生了顯著的不同。結(jié)合現(xiàn)有對自噬的認識及課題組前期在碳管的細胞生物學機制等方面的探索，我們推測兩種碳管由于表面修飾的不同結(jié)合在不同的細胞表面受體上，從而引起了不同的下游自噬通路。MWCNT-COOH通過IGF1R/mTOR/p70S6K通路引起自噬，而MWCNT41則通過IFNA2R干擾了IFNA2的表達，從而引起自噬。