基于納-微米多級孔結(jié)構(gòu)或寡肽修飾的聚乳酸類組織工程支架：構(gòu)建及對細胞作用研究.pdf

1、組織工程(Tissue Engineering)概念自20世紀80年代提出以來得到了迅速的發(fā)展，其基本原理和方法是：將體外培養(yǎng)擴增的正常組織細胞吸附于一種生物相容性良好并可被機體吸收的生物材料上形成復(fù)合物，將細胞—生物材料復(fù)合物植入機體組織或器官病損部位，細胞在生物材料逐漸被機體降解吸收的過程中形成新的具有形態(tài)和功能的相應(yīng)組織、器官，達到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。采用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建人工組織或器官，給急需組織修復(fù)和器官移植的病人帶來

2、了曙光。利用生物材料構(gòu)建的三維支架為細胞生長和功能化提供人工細胞外基質(zhì)和三維支撐。同時支架材料還能做為模板引導(dǎo)組織生長和整合，提供特殊的生物活性信號，誘導(dǎo)細胞定向分化和維持細胞功能。因此在為組織形成構(gòu)建特定環(huán)境時支架材料的選擇及其物理和化學(xué)性質(zhì)是關(guān)鍵。最近組織工程研究的重要趨勢是設(shè)計和制備在結(jié)構(gòu)和功能上仿生的支架材料，通過在支架中引入物理或/和化學(xué)生物信號獲得特異性細胞反應(yīng)，達到引導(dǎo)組織再生的目的。 因此，本論文研究首先構(gòu)建具有

3、納米/微米多級孔結(jié)構(gòu)的聚乳酸類三維支架，模仿天然細胞外基質(zhì)中膠原的顯微結(jié)構(gòu)——納米或亞微米纖維網(wǎng)絡(luò)，采用相分離技術(shù)構(gòu)建出系列具有微米多通道、微米孔徑和納米纖維的聚乳酸類組織工程支架，研究了支架微結(jié)構(gòu)與細胞之間的相互作用。在此基礎(chǔ)上，利用靜電紡絲技術(shù)制備具有不同拓撲形貌的納米纖維；合成出一種含端功能基團的PLLA，通過化學(xué)方式鍵合兩種層粘連蛋白衍生短肽。然后在2D支架中考察了它們在促進神經(jīng)細胞粘附和軸突長出的作用，為進一步仿生制備同時具有

4、生物學(xué)信息和物理誘導(dǎo)功能的組織工程支架提供科學(xué)依據(jù)。具體如下： 一、具有多縱向排列通道、多級孔結(jié)構(gòu)的PLGA導(dǎo)管的制備及在脊髓損傷修復(fù)中應(yīng)用研究 神經(jīng)導(dǎo)管可為神經(jīng)修復(fù)提供一個合適的微環(huán)境，使得神經(jīng)纖維能夠再生并順利到達遠端。在本章節(jié)研究中我們采用熱誘導(dǎo)相分離和低溫注射成型相結(jié)合的技術(shù)制備出具有可控多縱向排列通道、大孔/微孔多級結(jié)構(gòu)的PLGA神經(jīng)導(dǎo)管。神經(jīng)導(dǎo)管的外徑及內(nèi)部通道的數(shù)目和內(nèi)徑可以通過改變模具結(jié)構(gòu)控制，通道之間壁

5、的多孔結(jié)構(gòu)可以通過調(diào)節(jié)PLGA溶液濃度和進一步加入致孔劑控制。體外降解實驗顯示7通道神經(jīng)導(dǎo)管在37℃ PBS緩沖溶液中能夠保持外形12周，降解液pH值維持在4.1-4.5之間。大鼠脊髓間充質(zhì)干細胞(rat MSCs)單獨培養(yǎng)或者與大鼠雪旺細胞(rat SCs)共培養(yǎng)時能夠在神經(jīng)導(dǎo)管中很好的黏附、伸展和增殖，顯示出神經(jīng)導(dǎo)管具有良好的細胞相容性。PLGA神經(jīng)導(dǎo)管體內(nèi)移植到大鼠脊髓能夠很好的與宿主結(jié)合，沒有發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，并且有宿主細胞向

6、導(dǎo)管內(nèi)遷移，結(jié)果顯示導(dǎo)管在大鼠脊髓組織內(nèi)具有良好的相容性。因此本章節(jié)研究中所制備的PLGA多縱向排列通道、多級孔結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管在脊髓損傷修復(fù)中具有潛在的應(yīng)用前景。 二、具有納米纖維結(jié)構(gòu)的PCL—b—PLLA(50/50)三維多孔支架的制備與性能研究 采用液—液相分離和鹽瀝濾相結(jié)合的技術(shù)制備出PCL—b—PLLA三維多孔納米纖維支架，支架大孔孔徑為144±36μm，孔壁由直徑為151±56 nm的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。DSC結(jié)

7、果顯示嵌段共聚物PCL—b—PLLA為半晶質(zhì)聚合物，PCL鏈段和PLA鏈段在體系凝膠化過程中分別結(jié)晶但相互又有一定的干擾。低溫條件下易于凝膠化形成結(jié)晶微區(qū)，濾出溶劑冷凍干燥后即得到納米纖維結(jié)構(gòu)。納米纖維的形貌與凝膠化溫度相關(guān)，當5％(W/V) PCL—b—PLLA/THF溶液在—20℃和—40℃凝膠化時能夠形成均勻的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，而在4℃凝膠化時在納米纖維網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)片狀節(jié)點，升高凝膠化溫度會增大片狀結(jié)構(gòu)面積進而形成連續(xù)結(jié)構(gòu)。這主要是因為

8、PCL鏈段在THF溶液中的凝膠化溫度較低，以及PCL分子鏈重排受到PLA剛性段的干擾而致使結(jié)晶度下降，無定型部分比例升高。與平滑的實體孔壁相比，納米纖維結(jié)構(gòu)能夠促進軟骨細胞黏附和細胞外基質(zhì)的合成，納米纖維支架上軟骨細胞中蛋白質(zhì)含量和DNA含量分別是平滑實體孔壁支架上的1.3-1.4和1.2-1.4倍。研究結(jié)果表明這種具有多孔和納米纖維結(jié)構(gòu)的PCL—b—PLLA三維支架在軟骨組織工程中具有廣闊的應(yīng)用價值。 三、改進相分離技術(shù)制備具

9、有可控孔結(jié)構(gòu)的PLLA納米纖維支架 單獨以THF為溶劑制備的納米纖維支架中微孔孔徑在10μm以下，大大限制了該技術(shù)在組織工程中的應(yīng)用。在本章節(jié)研究中我們以二氧六環(huán)/水為共溶劑，制備出同時具有大孔/微孔和納米纖維結(jié)構(gòu)的PLLA三維支架。支架中大孔孔徑主要由相分離過程中粗化因素決定，而納米纖維網(wǎng)絡(luò)的形成則是由凝膠化過程中PLLA結(jié)晶引起。凝膠化溫度和雙組分溶劑比例是影響支架形貌的兩個重要因素。當凝膠化溫度為12℃，水含量分別為10％

10、和12％時，支架中微孔直徑為50±25μm，孔壁由纖維直徑在50-200 nm之間的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。升高凝膠化溫度或者增加水在雙組分溶劑中含量，支架孔徑增加，甚至會產(chǎn)生直徑達300μm的大孔。但是當凝膠化溫度高于12℃或水含量超過12％時，觀察到尺寸在微米級的片狀結(jié)構(gòu)而非納米纖維網(wǎng)絡(luò)。DSC分析結(jié)果顯示PLLA納米纖維支架材料的結(jié)晶度隨凝膠化溫度升高和水含量增加而升高，XRD結(jié)果進一步顯示納米纖維結(jié)構(gòu)中PLLA主要表現(xiàn)為α'晶型，而片

11、狀結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的晶型主要為α型。SEM和MTT檢測結(jié)果顯示納米纖維支架為大鼠脊髓間充質(zhì)干細胞(rat MSCs)黏附、伸展和增殖提供了一個比片狀結(jié)構(gòu)支架更好的環(huán)境。 四、具有不同拓撲形貌的PLLA靜電紡絲納米纖維的制備及對C17.2神經(jīng)干細胞生長和分化的影響 納米纖維能夠模仿天然細胞外基質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)，為細胞生長提供了一個良好的環(huán)境。然而細胞—納米纖維作用以及納米纖維拓撲形貌例如直徑和取向?qū)毎L和功能的影響在以往研究中卻

12、很少涉及，而細胞—材料作用在組織工程支架研究中具有重要的指導(dǎo)意義。在本章節(jié)中我們采用靜電紡絲技術(shù)制備了一系列具有不同取向和不同纖維直徑的PLLA纖維支架?？v向排列纖維的直徑在307±47 nm～917±84 nm之間，無規(guī)分布纖維的直徑在327±40 nm～1150±109 nm之間。纖維的直徑受各種因素影響，包括聚合物濃度、溶劑、電壓以及環(huán)境溫度和濕度。新生小鼠小腦C17.2干細胞在PLLA纖維上的活性和增殖不但受纖維直徑的影響而且也

13、受到纖維支架的孔徑影響。較小直徑的纖維能夠吸附更多的營養(yǎng)因子因而能促進細胞黏附和增殖，但太小的纖維直徑會產(chǎn)生較小的孔徑反而抑制細胞在纖維支架上滲透。纖維縱向排列時能夠引導(dǎo)細胞沿著纖維長軸方向生長和伸展，最后形成極化和拉長的胞體。而在無規(guī)分布纖維上的細胞則呈現(xiàn)出無規(guī)分布的梭形或者多角形。與無規(guī)分布纖維相比，纖維縱向排列時能促進細胞長出更長的神經(jīng)軸突，突顯其接觸引導(dǎo)效應(yīng)。因此我們的研究為纖維支架的設(shè)計和制備提供了重要的參考價值。 五

14、、兩種層粘連蛋白衍生短肽序列修飾改性PLLA及對C17.2神經(jīng)干細胞生長和分化影響 大量可降解吸收的聚酯類高分子已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物載體，但是由于缺乏功能基團，不能連接生物活性分子，其應(yīng)用也受到限制。在本章節(jié)中，首先合成賴氨酸封端的PLLA[K—(CH2)n—PLLA(n=2，5，8)]，通過改變賴氨酸與PLLA主鏈亞甲基數(shù)目調(diào)節(jié)連接末端氨基的臂長；然后將K—(CH2)n—PLLA與PLLA(10/90，W/W)復(fù)合澆注

15、成膜，采用極性水溶劑誘導(dǎo)聚合物中氨基向膜表面聚集。原子力顯微鏡觀察結(jié)果顯示復(fù)合膜與純PLLA膜相比表面粗糙度增加，由于K—(CH2)n—PLLA分子鏈末端氨基和PLLA主鏈骨架親水性的差異，復(fù)合膜表面出現(xiàn)微相分離現(xiàn)象。增加PLLA主鏈與賴氨酸的連接臂長、延長水誘導(dǎo)時間可以進一步增加膜的粗糙度，促進微相分離。利用雙偶聯(lián)劑Sulfo—SMCC將存在于層粘連蛋白中的兩個短肽序列CYIGSR(Cys—Tyr—Ile—Gly—Ser—Arg)和C

16、SIKVAV(Cys—Ser—Ile—Lys—Val—Ala—Val)與復(fù)合膜表面氨基鍵合，實現(xiàn)了短肽修飾PLLA的目的。與純PLLA膜相比，短肽修飾復(fù)合膜能夠提高新生小鼠小腦C17.2細胞的活性，促進細胞長出更長的神經(jīng)軸突，當連接臂長為5個亞甲基時(對應(yīng)于K—(CH2)5-PLLA/PLLA)，復(fù)合膜表面短肽密度達最大值(0.28±0.03μg/c㎡)，短肽對C17.2細胞的粘附和軸突長出的促進作用最為顯著。因此本章節(jié)的研究建立了一種