人脂肪干細胞及生物可降解聚乳酸-膠原支架構建組織工程輸尿管研究.pdf

1、研究背景及目的：輸尿管損傷后常常導致輸尿管缺損或狹窄，繼發(fā)患側尿路梗阻、感染、尿外滲、尿性囊腫等并發(fā)癥，嚴重威脅患者的健康及生活質量。對于損傷程度較重、缺損段較長的損傷，臨床上常以胃腸道替代輸尿管的方法處理。然而，腸代輸尿管后常伴隨各種并發(fā)癥的發(fā)生，如尿路結石，慢性感染，腸粘連等。有研究者嘗試使用人工合成材料或者異體移植的方法進行處理，但是治療效果均不滿意。因此，輸尿管損傷后缺損的治療已經成為泌尿外科的亟待解決的問題之一。組織工程科學的

2、發(fā)展為輸尿管損傷及缺損的修復重建提供了新的途徑。組織工程的方法進行輸尿管重建必須解決兩個關鍵問題：支架材料及種子細胞。本研究以人脂肪干細胞為種子細胞，以聚乳酸／膠原為基本材料制作一種新型輸尿管支架材料，擬為輸尿管組織工程重建提供一種新的可行的治療方法。
　　研究的主要目的為：
　　l、探索人脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定的方法，為以脂肪干細胞為種子細胞的研究提供實踐基礎：
　　2、探索人脂肪干細胞誘導分化為尿路上皮的可行

3、性；為輸尿管組織工程研究提供新的種子細胞來源：
　　3、制作一種新型組織工程輸尿管支架，并評估這種新型輸尿管支架是否利于人脂肪干細胞的生長、增殖：
　　4、將攜帶細胞的新型輸尿管支架置入裸鼠體內，評價材料的生物相容性，觀察支架材料內細胞存活狀態(tài)、誘導分化后的細胞表型能否保持，以初步評估利用這種新型輸尿管支架材料進行組織工程輸尿管的可行性。
　　方法：
　　1．取吸脂術患者皮下脂肪組織，采用酶消化法分離人脂肪干細胞

4、，通過流式細胞學的方法鑒定其表型特征，通過成脂、成骨誘導初步鑒定其分化潛能。
　　2．通過Transwell間接共培養(yǎng)法進行脂肪干細胞向尿路上皮細胞的誘導分化，采用RT-PCR、westernblot、免疫熒光的方法對誘導后的細胞進行尿路上皮標志物的(CK-18，UP2)表達鑒定。
　　3．以聚乳酸及I型膠原作為基本原料，采用溶劑揮發(fā)法及電紡絲方法制作一種新型生物可降解輸尿管支架材料，將脂肪干細胞與支架材料進行體外復合培養(yǎng)，

5、通過電鏡、LIVE/DEAD、H&E染色、MTT等方法評估新型輸尿管支架是否利于人脂肪干細胞的生長、增殖。
　　4．將攜帶人脂肪干細胞的新型輸尿管支架材料植入裸小鼠（4周齡雌性）背部皮下，生長14天后取材，進行細胞徑際分析、H&E染色、尿路上皮標志物的免疫熒光鑒定。
　　結果：
　　1．采用酶消化法分離的脂肪干細胞在細胞培養(yǎng)瓶內呈貼壁生長，倒置光學顯微鏡下觀察呈長梭形，流式細胞學檢測表明，細胞表達間充質干細胞的標志物（

6、CD29，CD44，CD90以及CD105），不表達造血干細胞標志物CD31及組織相容性抗原標志HLA-DR。成脂誘導14天后細胞內可見大量脂滴，并且油紅O染色呈陽性；成骨誘導21天后，茜素紅染色后觀察可見鈣結節(jié)形成。
　　2．通過與尿路上皮的間接共培養(yǎng)7天后，誘導后的細胞形態(tài)呈現(xiàn)尿路上皮細胞樣，培養(yǎng)14天后，RT-PCR及westernblot可檢測到尿路上皮標志物(CK-18、UP2)在基因轉錄及蛋白表達水平上調。免疫熒光檢測

7、表明，40％—50%的誘導后的干細胞表達尿路上皮標志物（CK-18及UP2）。
　　3．電鏡觀察聚乳酸／I型膠原輸尿管支架材料的表面具有三維空間結構，材料由直徑約3微米(3.44±0.94μm)的纖維構成，纖維間形成孔徑約10微米(10.54±3.18μm)的孔隙。細胞支架體外孵育培養(yǎng)后3天，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)支架材料表面細胞呈鋪展狀態(tài)，均勻分布于支架表面；MTT實驗對細胞種植在支架后第l，3，5，7天進行連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)攜帶膠原的支架材料

8、細胞呈現(xiàn)持續(xù)增殖的趨勢；細胞種植7天后H&E染色發(fā)現(xiàn)細胞均勻分布于支架材料表面，部分細胞浸潤生長進入材料的內部；Live/dead檢測發(fā)現(xiàn)材料上生長的細胞90%以上為活細胞。
　　4．所有16只動物在攜帶細胞的新型輸尿管支架材料植入體內14天的實驗期間均安全存活，傷口愈合良好，無感染、炎癥反應發(fā)生，誘導后的人脂肪干細胞能夠在裸鼠體內存活達14天，浸潤入支架材料的內部，并能夠表達尿路上皮的標志物。
　　結論：
　　1、采

9、用酶消化法提取人脂肪干細胞是可行的，提取的細胞能夠表達間充質細胞的標志物，具有良好的增殖及分化潛能。
　　2、采用間接共培養(yǎng)法能夠誘導人脂肪干細胞向尿路上皮細胞分化，誘導分化后的細胞形態(tài)發(fā)生改變，并且可表達尿路上皮的標志物。
　　3、采用聚乳酸／I型膠原材料制作的新型輸尿管支架材料，能夠適合人脂肪干細胞的生長增殖。
　　4、體內植入實驗證實攜帶細胞的新型輸尿管支架材料具有良好的生物學性能，誘導分化后的人脂肪干細胞在隨支