致病抗體血液凈化吸附劑的合成及性能研究.pdf

1、用于血液凈化治療自身免疫性疾病的蛋白A吸附柱屬于三類醫(yī)療器械，其內(nèi)部填充的蛋白A吸附劑能夠快速、有效地吸附清除患者血液中的致病抗體和免疫復合物，實現(xiàn)救治病人的目的，其臨床效果已得到醫(yī)生和病人的廣泛認可。由于作為吸附劑關鍵功能基的基因工程蛋白A存在售價昂貴、不易保存和消毒等缺陷，導致蛋白A吸附柱的臨床應用受限。本論文的主要研究內(nèi)容包括以下3個方面：(1)計算機分子模擬固定化配基與血漿中高豐度蛋白的結合，旨在有目的的篩選可能替代蛋白A的小分

2、子功能基；(2)在分子模擬的基礎上，實驗篩選對IgG具有選擇性吸附能力的小分子功能基，優(yōu)化吸附劑的合成并對其吸附性能進行評價；(3)研究篩選出的小分子功能基吸附劑對血漿中致病因子的清除能力及其安全性，并與商業(yè)化的蛋白A吸附劑進行比較，評價其取代蛋白A吸附劑進行血液凈化治療的可行性。 論文首先利用分子模擬軟件DOCK5.0模擬了固定化配基與血漿中的兩種高豐度蛋白質IgG及HSA的表面作用特征，分析了兩種蛋白質表面疏水區(qū)域的分布特點

3、。分析結果表明，IgG表面的疏水區(qū)域與HSA相比差異很大，IgG表面的疏水位點較多并相對分散，疏水口袋較淺，固定化配基可接觸程度較高；而HSA表面的疏水位點相對集中，疏水口袋較深，固定化配基可接觸程度較低。根據(jù)上述兩種蛋白質的表面特點，確認選擇固定化疏水配基有可能實現(xiàn)對IgG的選擇性吸附。 在上述研究基礎上，選擇了16種帶有不同疏水特性的小分子化合物為配基合成吸附劑，利用IgG和HSA為樣本評價了其對IgG的選擇性吸附能力，發(fā)現(xiàn)

4、，兼具疏水性和富電子特性的功能基對IgG的選擇性吸附能力遠高于HSA。進一步利用血清樣本評價其在復雜樣本中的選擇吸附特性，結果表明4-巰基乙基吡啶(MEP)吸附劑效果最佳。 吸附劑采用SepharoseCL-6B為載體，溴丙烯活化、N-溴代丁二酰亞胺溴化的方法偶聯(lián)MEP，以對血清中IgG具有較高吸附容量同時非特異吸附較低為目標，優(yōu)化了MEP吸附劑的合成條件，較優(yōu)化的合成條件為：SepharoseCL-6B在1.2mol/LNaO

5、H溶液中(凝膠與溶液體積比為1:1)經(jīng)20％溴丙烯(相對于凝膠的體積比)活化反應4h；帶有烯丙基活性基團的SepharoseCL-6B經(jīng)N-溴代丁二酰亞胺溴化后，在pH10的溶液條件下偶聯(lián)MEP分子。上述反應條件可控制吸附劑的配基密度在100-150μmol/mLgel，對IgG的動態(tài)結合容量為36.21mg/mL，對人血漿中抗體組分的吸附容量約為30mg/mL，占其血漿蛋白吸附總量的85％以上，其抗體結合能力和選擇性能夠滿足血液凈化吸

6、附劑的要求。 對MEP吸附劑清除自身免疫性疾病病人血清中致病因子的能力進行了系統(tǒng)研究。對于分子大小差異較大的致病因子，不同固定化密度的MEP吸附劑對其清除能力呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。對于分子量近900KDa的類風濕因子，當固定化MEP密度達到60μmol/mLgel時，對其清除能力達到95％以上，而對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的致病因子抗雙鏈DNA抗體，隨著固定化MEP密度的升高，病人血漿中抗雙鏈DNA抗體的去除率升高，當固定化MEP密度達到1

7、00μmol/mLgel時，抗雙鏈DNA抗體的去除率達到85％。進一步利用采自不同病人的樣本考察了MEP吸附劑對類風濕和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中致病因子清除的個體差異，并與商品化的ProteinA吸附劑進行比較。研究結果表明：MEP吸附劑對類風濕因子的清除率達到90％以上，其中陰性率為75％，基本沒有個體差異；而商品化的蛋白A吸附劑吸附后的陰性率僅為10％，大部分的清除率在12％至83％之間，個體差異明顯。但對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的致病因子抗核抗體

8、，MEP吸附劑的清除有效率為78％，商品化蛋白A清除有效率為57％，個體差異均較大。在總的致病因子清除效果方面，MEP吸附劑優(yōu)于商品化的蛋白A吸附劑。 論文進一步研究了MEP吸附劑的生物安全性，吸附劑浸出液的小鼠急性毒性實驗表明，MEP吸附劑的浸出液未對小鼠產(chǎn)生毒性，說明其中沒有有毒物質脫落。對狗進行的MEP吸附劑吸附實驗表明，利用該產(chǎn)品的治療過程安全可靠。 上述研究結果證實，MEP吸附劑對病人血漿中的致病因子具有較高的