β2-微球蛋白特異性血液凈化吸附劑制備及性能研究.pdf

1、β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)是主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子的輕鏈，參與免疫應(yīng)答和細(xì)胞間相互識(shí)別。在慢性腎衰竭患者體內(nèi)，β2M不能被正常代謝去除，也無(wú)法被普通透析有效清除，因此在體內(nèi)累積，誘發(fā)透析相關(guān)性淀粉樣變，是腎衰患者透析并發(fā)癥的主要致病毒素。血液凈化吸附去除β2M的治療方式已被臨床普遍采納，但目前所采用的非特異性吸附劑由于目標(biāo)選擇

2、性差，存在低效、高副作用的缺陷。本論文提出了一種基于駝源納米抗體的高選擇性免疫吸附劑的制備策略，針對(duì)人β2M篩選并制備了高親和力納米抗體，以此為配基合成吸附劑并驗(yàn)證了其應(yīng)用于血液凈化去除β2M的可行性，具體內(nèi)容如下:
　　(1)抗β2M納米抗體的篩選。應(yīng)用噬菌體展示庫(kù)技術(shù)篩選納米抗體，經(jīng)過(guò)4輪篩選，挑取了233個(gè)單克隆噬菌體樣品進(jìn)行ELISA比較親和活性，獲得了30個(gè)親和活性較好的噬菌體樣品，測(cè)序去除重復(fù)和錯(cuò)誤序列后，獲得13種高

3、親和活性的納米抗體序列，其中來(lái)源于免疫庫(kù)的有11種，這體現(xiàn)了免疫庫(kù)的多樣性。通過(guò)再次ELISA比較，最終確定4種親和活性最高的納米抗體序列A55、A82、A107、B82。
　　(2)納米抗體的制備與親和活性檢測(cè)。通過(guò)基因工程手段構(gòu)建4種納米抗體重組表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入兩種宿主菌中，宿主E.coli Shuffle T7的可溶納米抗體表達(dá)量?jī)?yōu)于E.coli Origami2。使用鎳柱親和純化，獲得了6種純度90％以上的納米抗體，即A

4、55S、A107S、B82S、A82S、A55O、A82O，其中產(chǎn)量最高的是A55S，達(dá)到100 mg/L。通過(guò)ELISA和Biacore分別定性和定量比較納米抗體的親和活性，發(fā)現(xiàn)納米抗體A55S的親和力最高，平衡解離常數(shù)(KD)達(dá)到2.931×10-6M。
　　(3)免疫吸附劑的制備與評(píng)價(jià)。通過(guò)比較5種納米抗體吸附劑的制備方法，發(fā)現(xiàn)使用ε-聚賴氨酸作為間隔臂的吸附劑D效果最好，但配基密度要控制，太高會(huì)引起納米抗體蛋白多點(diǎn)固載，導(dǎo)

5、致蛋白失活。在β2M上樣濃度2 mg/mL的條件下，吸附劑D1對(duì)β2M的動(dòng)態(tài)吸附容量高達(dá)11.45 mg/mL，但是相同條件的血漿體系中，其動(dòng)態(tài)吸附容量會(huì)顯著降低，血漿中其它物質(zhì)的非特異性吸附影響了β2M的吸附。
　　總之，本論文通過(guò)噬菌體展示庫(kù)技術(shù)篩選得到了高親和活性的納米抗體序列，并表達(dá)純化出抗體蛋白，測(cè)定其親和力，最后制備免疫吸附劑探索其應(yīng)用于血液凈化的可行性。然而，較強(qiáng)的非特異性吸附影響了吸附劑對(duì)β2M的去除效果，提高納米