Salmonella enterica中心代謝關(guān)鍵酶的賴氨酸可逆乙?；揎椦芯?pdf

1、蛋白質(zhì)翻譯后修飾是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容,賴氨酸可逆乙酰化修飾由于同組蛋白修飾、熱量限制、細(xì)胞凋亡、壽命延長(zhǎng)和轉(zhuǎn)錄沉默等生理過程密切相關(guān)逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。近年來(lái),有關(guān)真核生物的乙?；{(diào)控研究成果日新月異,而原核生物的乙酰化調(diào)控研究由于手段的缺乏和基礎(chǔ)的薄弱幾乎是處于停滯不前的狀態(tài)。
　　本論文利用賴氨酸乙?；贵w的特異性,結(jié)合免疫沉淀和質(zhì)譜技術(shù)的高效分離特性,首次對(duì)原核生物Salmonellaenterica的乙?；孜锏鞍走M(jìn)

2、行了蛋白組學(xué)水平的掃描,揭示乙?；揎椗c各種代謝關(guān)系密切;以可發(fā)酵碳源葡萄糖和不可發(fā)酵碳源檸檬酸為碳源,研究乙酰化修飾與不同代謝途徑之間的關(guān)系,并且從表型、生化和遺傳三個(gè)水平深入研究了乙酰化修飾對(duì)S.enterica中心代謝的調(diào)控機(jī)制,首次揭示賴氨酸可逆乙?；揎検侵行拇x在整體水平上的一種調(diào)控方式;同時(shí)結(jié)合我們合作實(shí)驗(yàn)室關(guān)于真核生物乙?；揎椀难芯拷Y(jié)果,提出賴氨酸可逆乙?；揎検且环N廣泛存在于真核和原核生物中的非常保守的中心代謝的調(diào)控

3、機(jī)制。
　　整個(gè)研究分為以下四個(gè)部分展開。
　　第一部分我們利用免疫沉淀的高靈敏性富集賴氨酸乙?；亩?并利用質(zhì)譜技術(shù)的高分辨率,首次對(duì)原核生物S.enterica的賴氨酸乙?；揎椀孜锏鞍自诘鞍捉M學(xué)水平上進(jìn)行了掃描研究,得到一系列與能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氨基酸和核酸合成等密切相關(guān)的乙酰化修飾底物蛋白。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有166個(gè)蛋白的190個(gè)肽段是乙酰化的,且其中的77個(gè)蛋白是與代謝相關(guān)的,這大大超出了我們對(duì)乙?；揎椀念A(yù)期,為

4、原核生物的乙?；芯块_辟了一個(gè)新的天地。
　　第二部分我們采用Red重組技術(shù)成功獲得了S.enterica的乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和/或去乙酰化酶(CobB)缺失的突變株,并對(duì)它們?cè)谄咸烟呛蜋幟仕釣槲ㄒ惶荚吹幕九囵B(yǎng)基上的生長(zhǎng)表型進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)S.enterica及其衍生菌株在不同碳源基本培養(yǎng)基中展示出截然不同的生長(zhǎng)表型,確認(rèn)了乙?；揎椗cS.enterica能量代謝之間的密切關(guān)系,并提出乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和去乙?；?

5、Cobb)可能是目前唯一已知的能夠?qū).enterica中心代謝關(guān)鍵酶起可逆乙?；揎椪{(diào)控的乙?；揎椕?。
　　第三部分我們克隆并表達(dá)了乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和去乙?；?CobB)以及中心代謝關(guān)鍵酶,如3-磷酸甘油醛脫氫酶(GapA)、異檸檬酸脫氫酶激酶,磷酸化酶(AceK)和異檸檬酸裂解酶(AceA),并在體外重構(gòu)Pat/CobB介導(dǎo)的乙酰化/去乙?；揎楏w系,研究乙?；揎棇?duì)這些酶活性的調(diào)控方式;同時(shí)構(gòu)建GapA、AceK和

6、AeeA乙?；揎椢稽c(diǎn)的點(diǎn)突變蛋白和敲除突變株,體外測(cè)定酶活力變化,研究這三個(gè)酶的具體乙酰化修飾位點(diǎn),并進(jìn)行表型互補(bǔ)試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GapA的脫氫酶活力與乙?；揎椪嚓P(guān),而AceK的激酶活力和AceA裂解酶活力與乙?；揎椮?fù)相關(guān),且GapA的第108、115、321和331位賴氨酸,AceK的第72、83和553位賴氨酸,AceA的第13和308位賴氨酸與乙?；揎椕芮邢嚓P(guān)。
　　第四部分我們以核糖體RNA16SrRNA為內(nèi)參基因

7、,利用定量熒光實(shí)時(shí)PCR研究乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和去乙?；?CobB)的轉(zhuǎn)錄與不同代謝途徑乙?；揎椫g的關(guān)系,結(jié)果顯示:在葡萄糖為碳源的情況下,pat和cobB的轉(zhuǎn)錄水平要高于檸檬酸為碳源;不管是葡萄糖還是以檸檬酸為碳源,對(duì)數(shù)期pat和cobB的轉(zhuǎn)錄水平均要高于它們?cè)诜€(wěn)定期和遲滯期的轉(zhuǎn)錄水平;提出存在一個(gè)乙?；瘽撃?patmRNA/cobBmRNA)的概念,即pat和cobb的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)Q定了不同時(shí)期的乙?；揎椝?。通過qRT-P

8、CR試驗(yàn),在轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證了乙酰化修飾與不同碳源代謝之間的相互關(guān)系。
　　綜上所述,本論文綜合乙?；揎椩谏?、生化和遺傳三個(gè)方面的證據(jù),驗(yàn)證了乙酰化修飾是一種廣泛存在于原核生物S.enterica中的調(diào)控方式;提出S.Enterica不同代謝通路轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制是通過乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和去乙?；?CobB)的共同作用,對(duì)中心代謝關(guān)鍵酶類如GapA,AceA和AceK等進(jìn)行可逆的乙?；揎?從整體水平上調(diào)控中心代謝;結(jié)合我們合作