基于基因組重排技術(shù)的紅法夫酵母蝦青素高產(chǎn)株選育.pdf

1、蝦青素是一種高附加值的酮式類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的淬滅單線態(tài)氧和清除氧自由基的能力，在食品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖業(yè)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。用紅法夫酵母生產(chǎn)蝦青素，具有發(fā)酵周期短，易于實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。本文用基因組重排技術(shù)對(duì)紅法夫酵母進(jìn)行育種，篩選高產(chǎn)菌株。 以紅法夫酵母野生菌株As2.1557作為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變，以75μmol/L的二苯胺作為篩選劑，最終選育出三株蝦青素高產(chǎn)菌株，其中蝦青素產(chǎn)量最高的

2、可達(dá)到1.188mg/L，較出發(fā)菌株提高了48％左右，且遺傳性狀穩(wěn)定。 對(duì)紅法夫酵母的原生質(zhì)體制備、再生以及融合條件進(jìn)行了研究。分別考察了菌體菌齡、酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度等因素對(duì)紅法夫酵母原生質(zhì)體制備和再生的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化紅法夫酵母原生質(zhì)體制備和再生的酶解條件，在該最優(yōu)條件紅法夫酵母原生質(zhì)體制備率和再生率之積可達(dá)到60％以上?？疾炝薖EG濃度、融合溫度、融合時(shí)間以及Ca2+濃度對(duì)紅法夫酵母原生質(zhì)體融合的影響，確定了紅

3、法夫酵母原生質(zhì)體融合的最適條件。并分別采用紫外線滅活法和熱滅活法滅活原生質(zhì)體，進(jìn)行滅活雙親原生質(zhì)體融合實(shí)驗(yàn)。 以復(fù)合誘變所得到的三株高產(chǎn)突變株以及實(shí)驗(yàn)室保藏的另一株抗β-紫羅酮高產(chǎn)突變株作為親本株，進(jìn)行基因組重排育種，第一輪通過抗性篩選融合子，第二輪中用雙親滅活原生質(zhì)體融合，最終篩選得到一株高產(chǎn)菌株，其蝦青素產(chǎn)量為1.950mg/L，比出發(fā)菌株提高了1.43倍，且遺傳性狀穩(wěn)定。 運(yùn)用代謝通量分析的方法，分析和對(duì)比了野生菌

4、株、基因組重排的親本株和重排之后得到的高產(chǎn)株的代謝通量分布情況。結(jié)果表明：重排菌株P(guān)P途徑的通量較親本株有所減小，但是EMP途徑和TCA循環(huán)的途徑的通量增大；用于生物質(zhì)合成的通量也略有增加；重排菌株的丙酮酸脫氫酶的反應(yīng)效率依然較低，約有32％的丙酮酸分泌到胞外。相關(guān)酶活實(shí)驗(yàn)表明，重排菌株的丙酮酸脫氫酶的活性提高有限，而與蝦青素的前體物乙酰輔酶A的生成有密切關(guān)系的檸檬酸裂解酶的活性則有顯著的增加，這一結(jié)果也從一定程度上闡明了重排菌株提高產(chǎn)