紅法夫酵母酶法破壁提取蝦青素及其β-環(huán)糊精包合的研究.pdf

1、紅法夫酵母堅(jiān)韌的細(xì)胞壁嚴(yán)重阻礙了其細(xì)胞內(nèi)蝦青素的提取及應(yīng)用，因此建立合適的細(xì)胞破壁方法以提高蝦青素的生物利用度及提取率是一個(gè)急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本論文研究了環(huán)狀芽孢桿菌胞壁溶解酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其用于紅法夫酵母破壁提取蝦青素，以及紅法夫酵母蝦青素的穩(wěn)定性及其β-環(huán)糊精包合保護(hù)方法，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：　　對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌B.circulansA1.383進(jìn)行紫外線誘變處理，經(jīng)過(guò)初篩、搖瓶復(fù)篩以及傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，獲得一株穩(wěn)定高產(chǎn)胞壁溶解酶的突變

2、株A1.383-2，其胞壁溶解酶產(chǎn)量比親株提高了116.9％。通過(guò)對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得出其生產(chǎn)胞壁溶解酶的適宜條件：碳源采用酵母葡聚糖，濃度為10g/L；氮源為蛋白胨與(NH4)2SO4混合，使其總濃度為4g/L；接種量6％～10％(v/v)；搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝液40mL；發(fā)酵溫度為30℃～35℃；培養(yǎng)基初始pH6.5～7.0。在上述條件下發(fā)酵54h后可獲得最高酶活74.6u/mL，比優(yōu)化前酶活提高了38.7％。

3、　　通過(guò)單因素及均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，確定了將B.circulansA1.383-2胞壁溶解酶用于紅法夫酵母破壁提取蝦青素的最佳酶作用條件，即當(dāng)pH值為5.0，加酶量為1614.5u/g干酵母，37℃溫和震蕩反應(yīng)16.5h，蝦青素的提取率可達(dá)到98％以上；此胞壁溶解酶穩(wěn)定的pH值范圍為4.8～9.8，在50℃以下表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性；對(duì)此胞壁溶解酶中多種酶活進(jìn)行了測(cè)定，確定該復(fù)合酶含有β-1，3-葡聚糖酶、纖維素酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶

4、以及木聚糖酶活性?！　?-脫氧-D-葡萄糖的存在會(huì)影響葡萄糖的正常代謝以及酵母細(xì)胞壁的合成，但實(shí)驗(yàn)表明，紅法夫酵母培養(yǎng)中添加0.005g/L-0.02g/L的2-脫氧-D-葡萄糖卻可促進(jìn)蝦青素積累，而且生物量基本保持不變，在增加蝦青素產(chǎn)量的同時(shí)還能縮短酶法破壁的時(shí)間。當(dāng)2-脫氧-D-葡萄糖添加濃度為0.02g/L，且在紅法夫酵母培養(yǎng)的前36h添加時(shí)，蝦青素含量可提高到對(duì)照組的113.7％，采用胞壁溶解酶對(duì)紅法夫酵母破壁提取蝦青素，作用

5、12h提取率可達(dá)94.7％。推測(cè)2-脫氧-D-葡萄糖促進(jìn)蝦青素合成的機(jī)理是由于其在細(xì)胞內(nèi)抑制了電子傳遞鏈的某個(gè)酶，從而阻斷呼吸鏈，造成氧自由基的大量積累，促使蝦青素的合成。　　通過(guò)對(duì)紅法夫酵母與環(huán)狀芽孢桿菌兩階段混合培養(yǎng)條件的優(yōu)化，總結(jié)出紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素及酶法破壁提取的適宜工藝為：培養(yǎng)基初始糖濃度為30g/L，環(huán)狀芽孢桿菌的最佳接種時(shí)間為紅法夫酵母培養(yǎng)60h～72h，接種量為10mL/L(1010個(gè)細(xì)胞/mL)，接種后最適培養(yǎng)溫度為

6、30℃，pH為6.5，總發(fā)酵時(shí)間為120h，在此條件下，紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量可達(dá)到8960.2ug/L，蝦青素最終提取率可達(dá)到96.8％。在兩階段混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了紅法夫酵母與環(huán)狀芽孢桿菌三階段混合培養(yǎng)方案，發(fā)酵結(jié)果表明，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加0.02g/L的2-脫氧-D-葡萄糖，三階段混合培養(yǎng)明顯優(yōu)于兩階段混合培養(yǎng)，不僅最終的蝦青素產(chǎn)量提高到9563.4ug/L，發(fā)酵時(shí)間也縮短為108h，提取率提高到97.4％，最終可提取出的

7、蝦青素總量為9314.8ug/L。　　蝦青素對(duì)短時(shí)受熱有較好的穩(wěn)定性，對(duì)光卻非常敏感，但無(wú)論是在加熱還是在光照條件下，酶法破壁提取的蝦青素比酸法及珠磨法破壁提取的更為穩(wěn)定；當(dāng)暴露在空氣中時(shí)，氧成為蝦青素褪色的另一個(gè)主要因素；有機(jī)溶劑中極性最小的石油醚有利于蝦青素的保存，而極性最大的丙酮?jiǎng)t十分不利于色素的保存，色拉油能很好的保護(hù)色素，因其較好地隔離了空氣中的氧，起到了一定的屏蔽作用。所以，應(yīng)采用避光、密閉、充氮或真空、低溫貯存的方法來(lái)延

8、緩紅法夫酵母蝦青素的褪色?！　≡砘芴岣呶r青素-β-環(huán)糊精包合的包合率；通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)包合物制備條件進(jìn)行優(yōu)化，可知在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，影響包合率各因素的主次為：D(轉(zhuǎn)速)＞C(時(shí)間)＞B(溫度)＞A(環(huán)糊精用量)，其中轉(zhuǎn)速為顯著影響因素；通過(guò)對(duì)攪拌時(shí)間及溫度進(jìn)行擴(kuò)展試驗(yàn)，確定了最佳包合條件為：β-環(huán)糊精加入量為7g/50mg蝦青素，溫度40℃，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，攪拌時(shí)間5h，在此條件下制備蝦青素-β-環(huán)糊精包合物，其包合率高達(dá)87