層層組裝聚磷酸酯與質(zhì)粒多層膜作為可控基因傳遞體系的研究.pdf

1、在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，治療疾病和創(chuàng)傷的方法往往需要傳達(dá)信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和控制細(xì)胞的死亡。這些信號(hào)包括促進(jìn)細(xì)胞黏附和細(xì)胞相互通訊的固定的配基、水溶性因子?，F(xiàn)存很多體內(nèi)體外的體系都能夠向細(xì)胞中傳遞水溶性生長因子。然而，由于蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定、易變性，體內(nèi)傳遞不能夠達(dá)到天然蛋白質(zhì)的治療效果。應(yīng)用基因治療的方法來傳遞生長因子已經(jīng)引起了人們的廣泛重視。這種方法利用DNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并利用細(xì)胞做為生產(chǎn)治療蛋白的機(jī)構(gòu)?；蛑委熭d體分為兩類，病毒類和

2、非病毒類。和病毒載體相比，合成聚合物載體可以大大降低毒性，但是它們的局限在于表達(dá)持續(xù)的時(shí)間和區(qū)域的限制。為了在非病毒載體中控制持續(xù)時(shí)間和基因表達(dá)的區(qū)域，一種辦法就是將DNA組分固定轉(zhuǎn)載在聚合物材料的局部位置，這樣的聚合物材料就能提供一個(gè)局部傳遞DNA的平臺(tái)。
　　 本文利用聚磷酸酯和質(zhì)粒DNA通過靜電組裝構(gòu)建了可以控制釋放活性質(zhì)粒DNA的多層膜，研究了成骨細(xì)胞在膜表面的黏附生長以及薄膜誘導(dǎo)細(xì)胞的持續(xù)轉(zhuǎn)染表達(dá)。
　　 首先

3、，利用層層自組裝技術(shù)，分別將聚陽離子聚乙烯基亞胺(PEI)，陽離子型聚磷酸酯(PPE-EA，PPE-HA)和聚陰離子聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)組裝成多層薄膜。首次通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了陽離子型聚磷酸酯(PPE-EA，PPE-HA)和聚陰離子聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)能夠靜電組裝成多層薄膜。
　　 其次，在前面實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用層層組裝方法將PPE-EA和DNA靜電組裝成多層膜。其中PPE-EA屬于一類陽離子型聚磷酸酯，它們主鏈上的酯鍵能

4、夠在水中降解。這種聚合物的陽離子性能夠和DNA進(jìn)行靜電組裝成膜，并且通過膜中聚合物的降解導(dǎo)致膜本身的解組裝。我們通過UV和QCM-D跟蹤測試了PPE-EA和DNA靜電組裝的整個(gè)過程，AFM圖像顯示了沉積的PPE-EA/DNA膜層層之間存在穿插結(jié)構(gòu)。
　　 將PPE-EA/DNA膜在37℃，PBS中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)薄膜發(fā)生降解，同時(shí)也將DNA釋放到培養(yǎng)溶液中，整個(gè)降解過程持續(xù)達(dá)到60天以上。AFM圖顯示，薄膜的降解是由膜表面顆粒的脫落開

5、始，逐步發(fā)展到薄膜內(nèi)部。TEM照片顯示，降解釋放產(chǎn)物為尺寸小于100 nm的顆粒，結(jié)合凝膠電泳實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)這些顆粒狀產(chǎn)物是PPE-EA/DNA復(fù)合物為主。特別是，凝膠電泳圖和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證實(shí)這些釋放的質(zhì)粒仍然保持了一定的生物活性。
　　 最后，為了測試PPE-EA/DNA膜在表面能否促進(jìn)細(xì)胞的局部和基于表面的體外細(xì)胞傳遞，我們將成骨細(xì)胞種植到薄膜表面培養(yǎng)。測試表明，成骨細(xì)胞在PPE-EA/DNA膜表面進(jìn)行黏附生長，而且膜表面能

6、夠促進(jìn)成骨細(xì)胞功能化。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在有血清存在的情況下，薄膜釋放的DNA能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)高水平的轉(zhuǎn)染表達(dá)。流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析顯示表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性率達(dá)到30-50％，釋放DNA傳遞的周期持續(xù)了40天。
　　 此外，我們對陽離子型聚合物的合成方法進(jìn)行一些改進(jìn)。采用了用叔丁氧碳基保護(hù)的乙醇胺和2-氯-2-氧-1，3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷反應(yīng)得到胺基被保護(hù)的單體PEEABoc。以異辛酸亞錫為催化劑，通過開環(huán)聚合合成了聚合物PP

7、EEABoc，脫保護(hù)即得到陽離子型聚合物PPEEA。這種新的合成方法很有潛力作為合成不同分子量的陽離子型聚磷酸酯的制備路線。
　　 綜上所述，我們通過層層自組裝方法構(gòu)建了聚磷酸酯(PPE-EA)/質(zhì)粒DNA膜，在細(xì)胞生長環(huán)境中薄膜的降解釋放能夠介導(dǎo)其表面生長的成骨細(xì)胞持續(xù)的高水平的轉(zhuǎn)染表達(dá)。這種可生物降解的多層膜將用于實(shí)現(xiàn)局部和持續(xù)的DNA傳遞，也為移植材料的表面修飾提供了另一種辦法，有潛力應(yīng)用于組織工程而誘導(dǎo)產(chǎn)生長效的基因表達(dá)