CyclinA-CDK2介導BAG3 Ser291位點的磷酸化并影響胃癌細胞的增殖和凋亡.pdf

1、目的：
　　明確CyclinA，CDK2，BAG3在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況及相關(guān)性，探討B(tài)AG3表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，初步研究BAG3及其S291位點磷酸化對于胃癌細胞增殖及抗凋亡能力的影響。
　　方法：
　　收集福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院胃外科2012年12月-2013年07月期間手術(shù)切除的180例新鮮胃癌組織及其癌旁組織，采用Western blot法檢測CyclinA，CDK2，BAG3的蛋白質(zhì)

2、表達情況；利用半定量免疫印跡實驗的灰度分析和統(tǒng)計學方法分析CyclinA，CDK2，BAG3之間的相關(guān)性及BAG3與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系；通過構(gòu)建BAG3過表達及沉默質(zhì)粒：BAG3-WT，BAG3-S291A，BAG3-S291D;BAG3-shRNA。采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將各個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胃癌細胞株MGC-803內(nèi)，分別用Neomycin和Puromycin篩選出過表達及沉默表達BAG3基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細胞株。通過CCK8和平板克

3、隆形成實驗檢測細胞增殖，通過流式細胞儀及WB檢測c-PARP分析細胞凋亡，通過熒光素酶實驗檢測FOXO1轉(zhuǎn)錄活性的改變，通過細胞免疫熒光及核質(zhì)分離檢測FOXO1的細胞內(nèi)定位變化。
　　結(jié)果：
　　1.BAG3在胃癌組織、癌旁組織中均有表達，其主要定位在細胞質(zhì)。與癌旁組織相比，BAG3在胃癌組織中的表達明顯下調(diào)，且 BAG3的表達量與CyclinA/CDK2的表達量呈負性相關(guān)。
　　2.CyclinA/CDK2可以磷酸化

4、BAG3的S291位點。
　　3.BAG3 S291位點磷酸化導致其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，即蛋白質(zhì)的半衰期變短。
　　4.胃癌細胞中BAG3發(fā)揮著抑制細胞增殖的作用，若S291位點持續(xù)磷酸化后抑制細胞增殖更為顯著。
　　5.過表達BAG3的胃癌細胞株對于奧沙利鉑誘發(fā)的凋亡更為敏感。
　　6.BAG3介導FOXO1入核并促進其靶基因 P27,Bim的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論：
　　1.BAG3在胃癌組織中的表達