尺寸可控高分子納米顆粒的制備及其應(yīng)用于納米藥物的研究.pdf

1、隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米藥物用于腫瘤的治療已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要前沿和熱點(diǎn)之一。納米藥物載體的優(yōu)勢(shì)是可以改善藥物的代謝動(dòng)力學(xué)和改變藥物的組織分布，從而提高療效和降低毒副作用。己有研究表明納米顆粒的穩(wěn)定性、尺寸大小以及表面的聚乙二醇(PEG)是影響其藥代動(dòng)力學(xué)和腫瘤靶向的重要因素。然而，制備穩(wěn)定的、PEG化以及具有尺寸可控的納米顆粒通常需要多步來完成。在本文中，利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，我們一鍋法制備具有內(nèi)核交聯(lián)、尺寸可控、表面PEG化的納

2、米顆粒(CNPs)。通過簡單調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中大分子單體聚乙二醇丙烯酸酯(mPEG-AC)、二丙烯酸乙烯酯(EGDA)以及含有六個(gè)巰基的交聯(lián)劑(TLA-6SH)的摩爾比例，納米顆粒的尺寸可在10-90 nm內(nèi)可控調(diào)節(jié)。該納米顆粒很容易分散在水中且具有良好的生物相容性。此外，其內(nèi)部疏水的空腔可以包埋藥物，而內(nèi)部未反應(yīng)的巰基與丙烯酸酯官能團(tuán)可以偶聯(lián)藥物或成像標(biāo)記。因此，該納米顆粒提供了一個(gè)多功能的藥物輸送平臺(tái)。
　　納米藥物腫瘤治療的過程

3、可分為三個(gè)過程:經(jīng)EPR傳遞到腫瘤部位;有效滲透到達(dá)腫瘤細(xì)胞并與其相互作用;最后進(jìn)入細(xì)胞將自由的藥物釋放到藥物作用靶點(diǎn)(如DNA)附近，使其發(fā)揮藥效。這一體內(nèi)藥物輸送過程遭遇多級(jí)屏障:系統(tǒng)屏障，腫瘤組織屏障，細(xì)胞屏障。因此，納米藥物必須同時(shí)成功地克服這些屏障才能實(shí)現(xiàn)高療效與低毒副作用的目標(biāo)。然而，很多關(guān)于納米藥物輸送的研究在藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后多是在分散在細(xì)胞質(zhì)中，很少在細(xì)胞核中。臨床應(yīng)用的抗癌藥物中大部分是作用細(xì)胞核中的DNA，如葸環(huán)類

4、抗生素(Anthracyclines)、順鉑(Cisplatin)和喜樹堿(CPT)等，它們通過損傷癌細(xì)胞核內(nèi)的DNA或抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮療效。然而，細(xì)胞的通過多種耐藥機(jī)制限制抗癌藥物進(jìn)入細(xì)胞核，使腫瘤對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療的失敗。因此，如果能夠繞過這些耐藥機(jī)制將藥物直接輸送到細(xì)胞核內(nèi)，就可能提高藥物的療效。最近，β-羧基酰胺化的陽離子聚合物如聚乙烯亞胺(PEI)等應(yīng)用于一類新型細(xì)胞核靶向的藥物載體，用于將抗癌藥物直

5、接輸送到細(xì)胞核中，從而使藥物避開腫瘤細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中的多種耐藥機(jī)制，顯著提高了療效。在論文的第二部分我們制備了一種新型的具有電荷翻轉(zhuǎn)能力的聚酯樹枝狀大分子(G4.5-DCA)并包埋了抗癌藥物阿霉素(DOX)，與兩嵌段聚乙二醇-b-聚賴氨酸共聚物(PEG-b-PLL)靜電自組裝得到一系列尺寸可控的納米藥物。由于納米藥物表面的PEG不僅可以阻止藥物在生理?xiàng)l件下的突釋，還可以減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial syste

6、m，RES)的攝取，延長血液中的滯留時(shí)間，從而增強(qiáng)腫瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)效應(yīng)。當(dāng)納米藥物被癌細(xì)胞內(nèi)吞并進(jìn)入酸性的溶酶體后，由于樹枝狀大分子表面的β-羧基酰胺鍵很快水解為胺基，從而使得自組裝納米藥物發(fā)生解離;帶有正電荷的樹枝狀大分子能夠逃離溶酶體并進(jìn)入細(xì)胞核，將藥物輸送到細(xì)胞核中。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明與游離阿霉素相比該納米藥物顯著提高了細(xì)胞毒性。
　　具體工作包括以下幾個(gè)方面:
　　第一章為文獻(xiàn)綜述，簡要總結(jié)了

7、納米藥物的分類、發(fā)展歷程以及最新進(jìn)展。
　　第二章的主要內(nèi)容是不同尺寸納米顆粒的合成與表征及載藥研究。以mPEG-AC與EGDA為起始原料，TLA-6SH為交聯(lián)劑，通過巰基與丙烯酸酯的點(diǎn)擊反應(yīng)制備了不同尺寸的硫酯納米顆粒(10-90nm)。利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)，原子力顯微鏡(AFM)，1H-NMR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。通過與疏水相互作用包埋了抗腫瘤藥物阿霉素(CNPs/DOX)，載藥量約為14％;利用2，2'-二硫二吡啶活化納米

8、顆粒內(nèi)部未反應(yīng)的巰基，成功地接上SN38。此外，通過將納米顆粒內(nèi)部的丙烯酸酯與半胱胺的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為胺基，可以用熒光染料Cy7標(biāo)記納米顆粒，從而用于后文的體內(nèi)試驗(yàn)。
　　第三章通過體外釋放、體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、藥物的亞細(xì)胞分布實(shí)驗(yàn)對(duì)不同尺寸的CNPs/DOX的體外活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。酸敏感釋放實(shí)驗(yàn)表明CNPs/DOX具有明顯的pH敏感釋放特性;隨后以乳腺癌Bcap37細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，采用MTT法測(cè)定不同尺寸CNPs/DOX的體外細(xì)胞毒性

9、，結(jié)果表明三種尺寸的CNPs/DOX均對(duì)Bcap37的生長具有良好的抑制作用，而CNPs本身具有很好的生物相容性;最后以BCap37細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型，通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)來觀察細(xì)胞對(duì)CNPs/DOX的攝取及胞內(nèi)分布情況，結(jié)果顯示CNPs/DOX能快速進(jìn)入細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長CNPs/DOX能在溶酶體酸性環(huán)境中釋放出游離DOX并進(jìn)入細(xì)胞核。
　　第四章評(píng)價(jià)了三種尺寸的CNPs/DOX的體內(nèi)分布、抑瘤與安全性。首先研究

10、了不同尺寸的CNPs與血漿清除速率間的關(guān)系。結(jié)果表明與游離DOX相比，CNPs/DOX顯著改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，且血液清除半衰期隨著CNPs的尺寸增加而延長;此外，我們發(fā)現(xiàn)包埋藥物的CNPs/DOX與鍵合的CNPs-Cy7顯示出不同的血漿清除行為。體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)顯示CNPs/DOX能通過EPR效應(yīng)明顯在腫瘤部位富集，且尺寸越大富集能力越強(qiáng)，這與血漿清除實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。CNPs/DOX體內(nèi)抗腫瘤療效理想，HE染色的結(jié)果表明與小分子阿霉素

11、相比其毒副作用顯著降低、安全性大大提高等優(yōu)勢(shì)。
　　第五章利用點(diǎn)擊反應(yīng)合成了不同代數(shù)的丁二胺為核的聚酯樹枝狀大分子，使用1H-NMR與GPC對(duì)其進(jìn)行表征。隨后用兩種酸酐3，4，5，6-四氫苯酐(DCA)和丁二酸酐(SA)對(duì)其表面進(jìn)行了改性，改性后的樹枝狀大分子具有良好的穩(wěn)定性以及水溶性;研究了D4.5-DCA與G4.5-SA在不同pH條件下電勢(shì)隨時(shí)間的變化情況，以及不同pH條件下的溶血能力，結(jié)果表明在酸性條件下(pH5.0) D4

12、.5-DCA具有良好的電荷翻轉(zhuǎn)能力和溶血能力;最后通過與兩嵌段聚乙二醇-聚賴氨酸(PEG-b-PLL)靜電自組裝形成穩(wěn)定的納米顆粒。調(diào)節(jié)PLL聚合度的不同，可以調(diào)控自組裝納米顆粒的尺寸。
　　第六章考察了G4.5-DCA包載阿霉素藥物的能力并研究了與PEG-b-PLL靜電自組裝情況?？疾炝梭w外釋放、體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、藥物的亞細(xì)胞分布及血漿清除曲線。酸敏感釋放實(shí)驗(yàn)表明PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)具有明顯的pH敏感釋

13、放特性且表面的PEG-b-PLL能有效阻止其在生理?xiàng)l件下的藥物突釋;采用MTT法測(cè)定了PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)的體外細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)對(duì)腫瘤細(xì)胞Bcap37和Hela的生長具有良好的抑制作用;通過CLSM來觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)的攝取及胞內(nèi)分布情況，結(jié)果表明PEG-b-PLL/G4.5-DCA(DOX)能將DOX輸送到細(xì)胞核;血漿清