紅樹(shù)林生境中高溫耐堿酯酶的篩選及基因克隆.pdf

1、酯酶是一種催化酯鍵水解和合成的酶的總稱(chēng)，它廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。由于自然界中微生物資源相對(duì)豐富，同時(shí)利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶具有便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，微生物酯酶得到關(guān)注，并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品業(yè)、醫(yī)藥化學(xué)、污水處理和生物修復(fù)等領(lǐng)域，而酯酶的酶促反應(yīng)具有較高的底物專(zhuān)一性、區(qū)域選擇性或者對(duì)映選擇性，它是合成手性化合物(如手性藥物，農(nóng)藥等)的高效生物催化劑，微生物酯酶已成為研究熱點(diǎn)。而紅樹(shù)林這一特殊環(huán)境蘊(yùn)藏了豐富微生物資源，可以分離到產(chǎn)

2、生多種具有特殊生物活性物質(zhì)的微生物。
　　本文從深圳福田紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)土壤樣品中分離純化獲得一株高酯酶活性的菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)初步鑒定該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，命名為Bacillus sp.W77。該菌株是耐鹽菌，其最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH為9.0，且在堿性范圍內(nèi)適應(yīng)性較好。
　　對(duì)所產(chǎn)的粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)的酯酶的最適反應(yīng)溫度是50℃，最適pH為8.0，且在堿性條件下較穩(wěn)定

3、；采用響應(yīng)面法(RSM)對(duì)土壤菌株Bacillus sp.W77的產(chǎn)酯酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最優(yōu)條件為：培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1.0 g，酵母粉6.67 g，K2HPO40.56 g，MgSO4·7H2O0.36 g，NaCl0.05 g，(NH4)2SO40.1 g，pH7.0，2％接種量接種到起始30 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37℃在轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h，在最佳產(chǎn)酶條件下，優(yōu)化后酯酶活力的OD405值

4、由0.829提高到1.235，實(shí)際值達(dá)到理論預(yù)測(cè)值的97.5%。
　　為了獲得菌株的酯酶基因，本論文構(gòu)建了該菌株的基因組文庫(kù)，通過(guò)酯酶的選擇培養(yǎng)基初步篩選具有酯酶活性的轉(zhuǎn)化子，其中一個(gè)含有1494 bp的HindⅢ酶切片段轉(zhuǎn)化子具有較強(qiáng)酯酶活性，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，該片段內(nèi)含一個(gè)由1470 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼489個(gè)氨基酸，G+C含量49.5%，等電點(diǎn)預(yù)測(cè)為4.96，預(yù)測(cè)編碼產(chǎn)物分子量約為54 kDa。同源性分析表明，該ORF與Ba