紅樹林胰α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生箘的分離篩選.pdf

1、α-淀粉酶抑制劑(α-Amylase Inhibitor，AI)是一種能夠抑制α-淀粉酶活性的糖苷酶抑制劑，在藥學(xué)和農(nóng)業(yè)方面均有廣泛應(yīng)用。在藥學(xué)方面，α-淀粉酶抑制劑主要用于防治糖尿病、高血脂和肥胖癥等疾病;在農(nóng)業(yè)方面，α-淀粉酶抑制劑可制備成生物農(nóng)藥或者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物的抗蟲性。
　　本論文對廣西北侖河口國家級自然保護(hù)區(qū)海水、海泥及紅樹林植物土壤中的微生物進(jìn)行α-淀粉酶抑制活性菌株的分離篩選，并根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特征

2、以及16srDNA序列分析來對菌株進(jìn)行初步的鑒定，同時優(yōu)化該目的菌株的發(fā)酵條件，以期達(dá)到提高該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的α-淀粉酶抑制劑含量。在此基礎(chǔ)上，對篩選出的目的菌株的發(fā)酵液進(jìn)行純化處理，采用大孔樹脂法、薄層層析法及硅膠層析法篩選出對α-淀粉酶抑制率最高的活性部位和成分，通過化學(xué)成分預(yù)試驗的方法初步確認(rèn)活性成分。
　　本論文采用稀釋涂布分離法從紅樹林土壤（采自廣西北侖河口國家級自然保護(hù)區(qū)）中篩選到137株菌株。其發(fā)酵液經(jīng)過瓊脂平板打洞

3、法初篩得到9株對胰α-淀粉酶產(chǎn)生抑制效果的菌株T1～T9。然后采用Bernfeld法對菌株T1-T9進(jìn)行復(fù)篩，同時以阿卡波糖作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)來自于紅樹林植物白骨壤的根部土壤中的T2菌株具有最好的抑制效果，其發(fā)酵原液對胰α-淀粉酶的抑制率為34.88％。1mg/mL的阿卡波糖對胰α-淀粉酶的抑制率為37.43％。
　　對目的菌株進(jìn)行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特征以及生理生化特征鑒定。將目的菌株T2接種到Zobell-2216E培養(yǎng)基上，恒溫

4、培養(yǎng)5d后，形成直徑約為4mm的白色而微微帶點透明的菌落。10d后再次觀察發(fā)現(xiàn)，菌落表面干燥而多皺，菌落反面為黃色，帶有泥腥味。菌落與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑取。將目的菌株T2接種到多種培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)特征鑒定，觀察發(fā)現(xiàn)該菌株能夠使明膠液化，牛奶凝固與胨化，能夠使硝酸鹽還原和淀粉水解，不能產(chǎn)生H2S和水解纖維素。能夠吸收利用葡萄糖、蔗糖、黃豆粉、甘露醇、肌醇這五種碳源。然后提取目的菌株的16srDNA進(jìn)行序列測定，測定結(jié)果與GenBank

5、文庫中的序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的菌株T2的16SrDNA序列與EU570682.1 Streptomyces sampsonii和AB249937.1 Streptomyces globisporus這兩個模式種的序列同源性很高，高達(dá)98％;目的菌株T2與EU570682.1 Streptomyces sampsonii處于同一分支中，結(jié)合菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、16SrDNA鑒定，初步鑒定目的菌株T2為鏈霉菌科鏈霉菌

6、屬的微生物。
　　通過單因素試驗和正交試驗來探究目的菌株T2的發(fā)酵條件。結(jié)果表明目的菌株T2能夠利用的較佳碳源和氮源分別是葡萄糖和蛋白胨，在正交試驗時發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度、初始pH值和裝瓶量這四個發(fā)酵條件中，對菌株產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑量的影響主次順序為發(fā)酵時間＞裝瓶量＞溫度＞初始pH值，其中發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑量的影響最大。各因素最優(yōu)水平為:A2(發(fā)酵時間168h)，B2（溫度28℃），C3（初始pH7.5），D1（裝瓶量

7、70mL）。利用最優(yōu)組合A2B2C3D1進(jìn)行發(fā)酵，所獲得的發(fā)酵原液取0.25mL進(jìn)行α-淀粉酶的抑制率測定，發(fā)現(xiàn)其對α-淀粉酶的抑制率表現(xiàn)最高為57.43％。
　　采用超聲波法（分別選用水、乙醇、石油醚作為溶劑）輔助提取發(fā)酵液活性成分，進(jìn)行抑制活性測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水相濃縮液對α-淀粉酶的抑制率最高為70.32％（相當(dāng)于9.65mL的發(fā)酵原液）;醇提液濃縮液對α-淀粉酶的抑制率為17.13％（相當(dāng)于2.35mL的發(fā)酵原液）;石油醚萃取

8、濃縮液對α-淀粉酶的抑制率為6.73％（相當(dāng)于0.92mL的發(fā)酵原液）;可見目的產(chǎn)物的極性比較大，選用水相進(jìn)行后續(xù)實驗。在對水相純化過程中，選用五種大孔吸附樹脂，比較后選用大孔吸附樹脂D101進(jìn)行第一步純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用水洗脫的組分抑制率最高，對α-淀粉酶的抑制率達(dá)到67.43％（相當(dāng)于9.26mL的發(fā)酵原液）。其次是20％乙醇洗脫液的組分，對α-淀粉酶的抑制率為21.18％（相當(dāng)于2.91mL的發(fā)酵原液）。對水洗脫的組分采用硅膠柱層析的

9、方法進(jìn)行進(jìn)一步的純化，通過薄層層析篩選其溶劑洗脫系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明，用氯仿∶甲醇系統(tǒng)（比例為3∶1）進(jìn)行洗脫，可獲得對α-淀粉酶的抑制率最大為81.69％的組分（相當(dāng)于11.22mL的發(fā)酵原液）。同時，1mg/mL的阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制率為78.32％。比較后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)多次純化后的發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制效果要好于1mg/mL的阿卡波糖。將收集的組分進(jìn)行減壓濃縮后得到浸膏，進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)實驗，初步確定組分中的主要成分是糖苷類和蛋