應(yīng)用拉曼光譜和超光譜成像技術(shù)識(shí)別周圍神經(jīng)纖維及神經(jīng)束功能性質(zhì)和顯微結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、研究背景:周圍神經(jīng)損傷是骨科臨床的常見疾病，其損傷后的修復(fù)與再生一直是國內(nèi)外學(xué)者重點(diǎn)研究的課題。神經(jīng)功能恢復(fù)不理想的主要原因是運(yùn)動(dòng)或感覺神經(jīng)纖維之間的錯(cuò)向吻合。因此，如何在手術(shù)中對周圍神經(jīng)束的性質(zhì)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識(shí)別是當(dāng)前迫切需要解決的問題之一，對于臨床上周圍神經(jīng)損傷術(shù)中手術(shù)方式的選擇具有較好的參考價(jià)值。
　　過去臨床上識(shí)別神經(jīng)束功能性質(zhì)的方法主要可歸為以下幾類:(1)根據(jù)解剖學(xué)特點(diǎn)和術(shù)中探查判斷;(2)術(shù)中喚醒和電流刺激;(3)

2、膽堿酯酶或碳酸酐酶組織化學(xué)染色;(4)同位素法測量乙酰基膽堿轉(zhuǎn)移酶活性等。這些方法普遍耗時(shí)較長，不能滿足手術(shù)中快速鑒別神經(jīng)束功能性質(zhì)的要求。
　　近來有學(xué)者提出使用各種光學(xué)方法區(qū)分神經(jīng)束功能性質(zhì)的想法。拉曼光譜能夠反映微小生物標(biāo)本內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的含量及其化學(xué)結(jié)構(gòu)和變化，具有實(shí)時(shí)快速、不破壞細(xì)胞、敏感性強(qiáng)、分辨率高、能夠定性定量等優(yōu)勢;超光譜成像技術(shù)能同時(shí)提供生物組織樣本圖像和光譜兩方面的信息，對檢測標(biāo)本進(jìn)行定性、定量和定位的

3、描述，相比其它醫(yī)學(xué)成像技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢。國內(nèi)外有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于在組織學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)、中醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域中使用顯微拉曼光譜和超光譜成像技術(shù)區(qū)分各種組織和細(xì)胞的成功先例。
　　研究目的:
　　1、研究周圍神經(jīng)感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維顯微拉曼光譜的特征。
　　2、研究Karnovsky-Roots染色對感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維拉曼光譜的影響。
　　3、評(píng)價(jià)使用顯微拉曼光譜技術(shù)對經(jīng)Karnovsky-Roots染色處理30分

4、鐘的脊髓前根和后根神經(jīng)纖維進(jìn)行快速鑒別的可靠性和可行性。
　　4、研究周圍神經(jīng)束斷面分子超光譜成像的表現(xiàn)。
　　5、通過計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理和組織生化方法輔助，探討超光譜技術(shù)識(shí)別周圍神經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)的可行性。
　　研究方法:
　　1、取新西蘭大白兔20只，每次10只分2次取材。分別取其雙側(cè)骶1脊髓前根和后根制備成純運(yùn)動(dòng)神經(jīng)或感覺神經(jīng)纖維的兔周圍神經(jīng)標(biāo)本，共80例;另取1例臨床因非缺血壞死性疾病致膝上截肢的人腓總神經(jīng)標(biāo)本，切

5、成5段。標(biāo)本于-80℃冷凍貯存，實(shí)驗(yàn)時(shí)取出在-20℃下制作冰凍切片，拉曼光譜實(shí)驗(yàn)使用厚度為30μm的兔神經(jīng)切片，超光譜成像實(shí)驗(yàn)使用厚度為10μm的兔和人神經(jīng)切片。
　　2、隨機(jī)各選取10例脊髓前根和脊髓后根標(biāo)本切片進(jìn)行顯微拉曼光譜掃描，獲取周圍神經(jīng)纖維的拉曼光譜，并對其峰值和峰值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、隨機(jī)各選取3例脊髓前根和脊髓后根標(biāo)本切片，每例作4張連續(xù)切片，直接采集拉曼光譜數(shù)據(jù)，再隨機(jī)各將各標(biāo)本連續(xù)切片分別歸入4

6、組之一，進(jìn)行Karnovsky-Roots組染色8小時(shí)、30分鐘，以及0.1 M碘化硫代乙酰膽堿溶液或0.05％新斯的明注射液浸泡孵育8小時(shí)處理，之后再次行拉曼光譜掃描，研究不同試劑處理后對原始神經(jīng)纖維拉曼光譜的修飾效果。
　　4、選取各20例脊髓前根和脊髓后根標(biāo)本切片，進(jìn)行Karnovsky-Roots染色30分鐘后采集拉曼光譜，統(tǒng)計(jì)歸納經(jīng)快速染色的脊髓前根拉曼光譜的變化規(guī)律。
　　5、選取第二次取材的各20例脊髓前根和后

7、根標(biāo)本切片，Karnovsky-Roots染色30分鐘后進(jìn)行拉曼光譜采集，統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)該方法快速識(shí)別周圍神經(jīng)纖維功能性質(zhì)的效果。
　　6、隨機(jī)選取各3例兔脊髓前根和脊髓后根標(biāo)本及3例人腓總神經(jīng)標(biāo)本切片進(jìn)行分子超光譜成像，每張切片在x20和x40下按所需觀察結(jié)構(gòu)每次圈取15個(gè)感興趣區(qū)域，計(jì)算得到周圍神經(jīng)束斷面各顯微結(jié)構(gòu)的特征性光譜曲線。
　　7、計(jì)算機(jī)處理數(shù)據(jù)，在ENVI中使用光譜角匹配法識(shí)別周圍神經(jīng)斷面的髓鞘，并生成偽彩色圖像用

8、于直觀觀察。
　　8、隨機(jī)選取3例兔運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維和感覺神經(jīng)纖維標(biāo)本切片Karnovsky-Roots染色后進(jìn)行分子超光譜成像，每張切片按所需觀察結(jié)構(gòu)每次圈取15個(gè)感興趣區(qū)域，探討染色對功能束纖維光譜曲線的影響。
　　結(jié)果:
　　1、周圍神經(jīng)纖維在550 cm-1、1080 cm-1、1110 cm-1、1280 cm-1、1440 cm-1、1660cm-1附近表現(xiàn)出強(qiáng)度明顯的拉曼強(qiáng)度，而其中一般以1440 cm-1處

9、的強(qiáng)度為最高。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維與感覺神經(jīng)纖維的拉曼光譜之間沒有顯著差異。
　　2、Karnovsky-Roots染色8小時(shí)后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維在原有峰位以外的480 cm-1、510cm-1、595 cm-1、2110 cm-1、2155cm-1處有很強(qiáng)的拉曼強(qiáng)度;染色30分鐘時(shí)各峰較8小時(shí)染色時(shí)弱但在2100 cm-1～2160 cm-1仍明顯;感覺神經(jīng)纖維拉曼光譜與染色前相同。染色30分鐘后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)與感覺神經(jīng)纖維I2100/I1440存

10、在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001); I2100/I1440＞0.2可認(rèn)為染色陽性。
　　3、使用顯微拉曼光譜聯(lián)合Karnovsky-Roots染色30分鐘的方法對脊髓前根和后根各20例進(jìn)行識(shí)別，20根脊髓前根全部正確識(shí)別，19根脊髓后根正確識(shí)別，1根脊髓后根被錯(cuò)誤認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維。
　　4、在超光譜成像下，周圍神經(jīng)軸突及髓鞘具有各自特征性光譜曲線。標(biāo)本物種和放大倍數(shù)對曲線趨勢無明顯影響。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)與感覺神經(jīng)纖維的光譜曲線趨勢一

11、致。
　　5、使用光譜角匹配法，α=0.10時(shí)可以直接將神經(jīng)束斷面中的髓鞘結(jié)構(gòu)識(shí)別并通過偽彩色圖像表現(xiàn)。使用該法不能直接對神經(jīng)功能束中神經(jīng)纖維進(jìn)行識(shí)別，即使染色后進(jìn)行識(shí)別仍在可重復(fù)性上有所欠缺。
　　結(jié)論:
　　1、周圍神經(jīng)運(yùn)動(dòng)與感覺神經(jīng)纖維的顯微拉曼光譜近似，難以直接區(qū)分。
　　2、顯微拉曼光譜能夠?qū)?jīng)Karnovsky-Roots染色處理30分鐘的脊髓前根和后根神經(jīng)纖維進(jìn)行快速鑒別。在本研究中，截?cái)帱c(diǎn)為I21