可通過(guò)BBB的BDNF融合蛋白保護(hù)腦缺血后神經(jīng)元死亡的藥效學(xué)和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neuotrophic factor，BDNF)是1982年德國(guó)神經(jīng)生物學(xué)家Barde等首次從豬腦中分離出來(lái)的具有防止神經(jīng)元死亡功能的小分子蛋白質(zhì)，它主要由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中最具代表性的成員之一。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，對(duì)神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)和功能起著重要的作用，在病理狀態(tài)下，可促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的修復(fù)。例如大腦缺血后，機(jī)體

2、在沒(méi)有外來(lái)因素干預(yù)下，內(nèi)源性BDNF可通過(guò)自身代償調(diào)節(jié)，提高神經(jīng)元抵抗缺血的能力，促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)、再生，調(diào)節(jié)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建，促進(jìn)腦損傷后認(rèn)知功能的恢復(fù)。但機(jī)體自身的代償能力有限，持續(xù)時(shí)間較短，隨著腦缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)源性BDNF表達(dá)逐漸降低，同時(shí)神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)過(guò)程及其后的生長(zhǎng)必須經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間，內(nèi)源性BDNF及其受體酪氨酸激酶受體(trkB)的上調(diào)尚不足以防治腦缺血性損傷及其以后的細(xì)胞死亡。大量實(shí)驗(yàn)表明給予外源性BDNF在抵抗

3、神經(jīng)損傷，促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)、維持神經(jīng)元的功能等方面的作用已經(jīng)較為肯定。因此，應(yīng)用外源性BDNF給藥到達(dá)大腦發(fā)揮生物學(xué)功能將是治療缺血性腦損傷的一個(gè)很有潛力的治療方法。但由于血腦屏障的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，限制了血液和腦組織之間的物質(zhì)交換，因此，外源性蛋白很難通過(guò)血腦屏障，這也是至今為止，醫(yī)藥市場(chǎng)上幾乎沒(méi)有有效的用于預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的蛋白類(lèi)藥物。如何解決血腦屏障通透性及腦靶向給藥途徑成為外源性BDNF應(yīng)用的關(guān)鍵，也是醫(yī)藥及相關(guān)領(lǐng)域研究者迫切解決

4、和關(guān)注的問(wèn)題。
　　 這就使得臨床上急需一種有效的，非侵入性的方法使腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)血腦屏障而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，用以滿足BDNF在神經(jīng)退行性疾病方面的預(yù)防及治療作用。目前在臨床前試驗(yàn)研究中試探了許多的給藥方法，主要分為兩類(lèi):侵入性和非侵入性。前者主要包括腦血管內(nèi)灌注或腦內(nèi)注射給藥;后者主要采用高分子技術(shù)或基因工程技術(shù)對(duì)BDNF進(jìn)行修飾，主要有脂質(zhì)體包裹藥物;病毒基因治療的給藥途徑;單克隆抗體偶聯(lián)藥物進(jìn)行靜脈給藥等。但這些方法

5、存在很多的不足:腦血管內(nèi)灌注或腦內(nèi)注射給藥有極大的不順應(yīng)性，且給藥后，藥物分布在很小的部位;用脂質(zhì)體包裹藥物能增加藥物的脂溶性，但腦組織對(duì)脂質(zhì)體的攝入是絕對(duì)的非特異性的，同時(shí)也增加了藥物的副作用和成本;病毒基因載體給藥雖然是很好的入腦載體，但并不適合臨床上的急性缺血的腦損傷的治療，因?yàn)樵谀X損傷后很短的時(shí)間內(nèi)給藥才能對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)和修復(fù)作用，而且病毒載體對(duì)人的免疫系統(tǒng)有副作用;單克隆抗體偶聯(lián)藥物進(jìn)行靜脈給藥能夠使得BDNF通過(guò)血腦屏障

6、到達(dá)大腦而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，但這種方法得到的藥物，過(guò)程繁瑣，半衰期短，成本高。如何尋找一種有效的，非入侵性的臨床給藥方法，使得BDNF進(jìn)入大腦發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，這是目前我們最為關(guān)注和急待解決的問(wèn)題。
　　 來(lái)源于人免疫缺陷病毒的反式轉(zhuǎn)錄激活因子(Transactivator of transcription，TAT)能夠跨膜導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，具有細(xì)胞膜穿透肽(Cell membrane penetratingpeptide，CPP)活性

7、，這一研究發(fā)現(xiàn)給我們解決這個(gè)問(wèn)題提供了很好的思路。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（Protein transduction domain，PTD）是指那些小于20個(gè)氨基酸、帶正電荷，可以穿過(guò)大多數(shù)細(xì)胞膜的穿膜肽(CPP)的一個(gè)富含堿性氨基酸區(qū)域，帶正電荷的多肽片段，是行使蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的特殊結(jié)構(gòu)域?？梢詳y帶大分子透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，而無(wú)需特殊的環(huán)境。另外，穿膜肽對(duì)于結(jié)合物的大小沒(méi)有嚴(yán)格的限制，已經(jīng)在腫瘤，免疫治療等很多臨床前研究中取得了很

8、大的進(jìn)展，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 本課題組在前期研究中，克隆獲得了編碼成熟BDNF-PTD融合蛋白的基因，建立了能表達(dá)BDNF-PTD融合蛋白的大腸桿菌細(xì)胞系，通過(guò)純化和鑒定，得到了BDNF-PTD，前期研究證明BDNF-PTD融合蛋白可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦。在此基礎(chǔ)上，本課題將對(duì)BDNF-PTD的藥效學(xué)進(jìn)行體內(nèi)外研究，并對(duì)其作用機(jī)制展開(kāi)了研究。
　　 目的:
　　 1、制備穩(wěn)定性好、重復(fù)性強(qiáng)、成功率高的大鼠

9、局部腦缺血模型。與普通尼龍栓線對(duì)比，確定通過(guò)石蠟包被后的栓線對(duì)于制備的大腦中動(dòng)脈栓塞局部缺血模型的效果;同時(shí)，研究不同損傷再灌注方式對(duì)大鼠局部腦缺血模型神經(jīng)功能缺陷、梗死面積、血腦屏障通透性的影響。
　　 2、體外藥效學(xué)研究，研究不同劑量的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠胎鼠背根神經(jīng)節(jié)軸突生長(zhǎng)的影響;并觀察驗(yàn)證BDNF經(jīng)過(guò)與PTD重組后表達(dá)，純化得到的融合蛋白是否具有和BDNF一樣的生物學(xué)活性和功效。

10、
　　 3、體內(nèi)藥效學(xué)研究，研究不同給藥時(shí)間，不同給藥劑量BDNF-PTD對(duì)大鼠大腦缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的神經(jīng)功能缺陷，缺血梗死面積的影響，觀察BDNF-PTD在腦缺血后對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　 4、研究BDNF-PTD對(duì)大鼠大腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致神經(jīng)元損傷保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 一、大鼠局部腦缺血模型的制備及其優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
　　 用普通尼龍栓線和改良栓線制備大鼠局部腦缺血/再

11、灌注損傷模型。改良栓線制備方法:將尼龍栓線切成70mm，將線頭置于浸滿液體石蠟的0.28mm微管中。等石蠟?zāi)毯?，移開(kāi)微管，為了保持栓線的一致性，最好同一個(gè)人制備完成。采用神經(jīng)功能缺陷評(píng)分法以及TTC染色法，對(duì)比改良線栓與普通尼龍栓線制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型的效果。另外，通過(guò)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分法，TTC染色法以及伊文思藍(lán)染色法分析不同栓塞/再灌注損傷方式對(duì)大鼠局部缺血模型神經(jīng)功能缺陷、梗死面積、血腦屏障通透性的影響，并確定在后期實(shí)驗(yàn)中制

12、備模型采取何種方式。
　　 二、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠胎鼠背根神經(jīng)節(jié)軸突生長(zhǎng)的影響
　　 在體式顯微鏡下取大鼠胎鼠（E18-20天）背跟神經(jīng)節(jié)，置于6孔板中，4個(gè)/孔，隨機(jī)分組，陰性對(duì)照組（DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液）、陽(yáng)性對(duì)照組（含BDNF的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，50ng/ml），實(shí)驗(yàn)組（含不同濃度BDNF-PTD的DMEM培養(yǎng)液，10ng/ml，50ng/ml，80ng/ml，100ng/ml），

13、N=3。首先加入300μL相應(yīng)的培養(yǎng)液，移入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)孵育4h，背根神經(jīng)節(jié)貼壁后，補(bǔ)足相應(yīng)的培養(yǎng)液至2mL.。48 h后，倒置顯微鏡下觀察軸突生長(zhǎng)形狀態(tài)，并拍照。計(jì)算最長(zhǎng)軸突長(zhǎng)度（μm），和軸突的生長(zhǎng)面積，各組的軸突生長(zhǎng)面積用實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較的百分比表示，軸突長(zhǎng)度用μm表示。所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用(x)±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件分析數(shù)據(jù)。
　　 三、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-

14、PTD)對(duì)大鼠局灶性腦缺血預(yù)防治療作用的藥效學(xué)研究
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組，空白模型組，給藥組(50μg，100μg)。給藥模型組在栓塞前和栓塞后一個(gè)小時(shí)腹腔注射BDNF-PTD50μg，100μg，大鼠大腦局部缺血/再灌注24小時(shí)快速取腦，用生理鹽水洗去表面的血跡，在-30℃下冷凍10min。冠狀面切片，每片2mm，37℃恒溫箱中2％TTC避光染色10min，然后用多聚甲醛固定24小時(shí)。經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫

15、瑰紅色，梗塞區(qū)為白色。然后將固定好的各組大鼠大腦TTC染色切片用Wincats分析軟件對(duì)其進(jìn)行掃描，再用ImageJ軟件計(jì)算各組的梗死面積，并進(jìn)行分析。
　　 四、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠局部腦缺血治療作用的機(jī)制研究
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組，空白模型組，給藥組。給藥模型組在栓塞后一個(gè)小時(shí)腹腔注射BDNF-PTD50μg，大鼠大腦局部缺血/再灌注24小時(shí)后，快速斷頭取腦，將腦

16、組織迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，使用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，此過(guò)程在冰上進(jìn)行。之后通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)大腦中BDNF、P-Erk1/2、Erk1/2、PI3K以及內(nèi)參GAPDH蛋白的表達(dá)。所得到的結(jié)果通過(guò)Gel-Pro專業(yè)圖像軟件分析。
　　 結(jié)果:
　　 一、大鼠局灶性腦缺血模型的制備及其優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
　　 改良后的栓線制備大鼠局部腦缺血模型組（簡(jiǎn)稱:cMCAO），其死亡率為0％，成功率為100％;而使用普

17、通尼龍栓線制備大鼠局部腦缺血模型組（簡(jiǎn)稱:uMCAO），其死亡率為10％，成功率為55％，其主要原因是由于栓線頭尖銳導(dǎo)致顱內(nèi)出血所致。大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞6小時(shí)后，進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷程度的評(píng)分，改良栓線組(cMCAO)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分高于普通栓線組(uMCAO)，組間比較有差異(F=17.292，P=0.01)。通過(guò)大鼠CCA進(jìn)線栓塞大腦中動(dòng)脈后，12小時(shí)斷頭取腦，冠狀切片，TTC染色，結(jié)果顯示在普通栓塞組(uMCAO)中，只有11只大鼠大

18、腦有梗死區(qū)域（2只死亡，7只模型失?。?n=20)，而在改良栓線組(cMCAO)中，所有實(shí)驗(yàn)大鼠都有梗死區(qū)域。軟件分析計(jì)算得出cMCAO組的梗死面積大于uMCAO組，其平均梗死面積高于uMCAO組209.97％，組間比較具有差異(F=98.897，P=0.015)。
　　 另外在兩種缺血再灌注方式上，在Group C中，其灌注主要血液來(lái)源CCA和ICA，而在Croup W，其主要灌注血液來(lái)自Willis環(huán)(除了ICA)，數(shù)據(jù)顯示

19、但Group C評(píng)分比group W高，但統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示兩組動(dòng)物神經(jīng)功能缺陷無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.000，P=0.328)。大鼠栓塞后斷頭取腦，冠狀切片，每片約2mm，TTC染色，結(jié)果顯示group C組大鼠的梗死面積大于group W組大鼠124.79％，但兩組梗死面積差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3.5，P=0.075)。
　　 二、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)植塊的影響
　　

20、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DRG在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液條件下，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)48小時(shí)后，神經(jīng)節(jié)軸突仍然沒(méi)有明顯生長(zhǎng)。而B(niǎo)DNF-PTD共培養(yǎng)后可明顯促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)軸突的生長(zhǎng)。與陰性對(duì)照組相比，不同濃度的BDNF-PTD均可使軸突長(zhǎng)度增加，生長(zhǎng)面積增大。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，相同劑量的BDNF-PTDT對(duì)促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)軸突生長(zhǎng)和生長(zhǎng)面積沒(méi)有顯著性差異。
　　 在給藥組中通過(guò)軟件分析背根神經(jīng)節(jié)軸突生長(zhǎng)面積數(shù)據(jù)，各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=31.697，

21、P=0.000)，各組藥組能明顯促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)數(shù)量的生長(zhǎng)，50ng/m，80ng/ml，100ng/ml濃度的BDNF-PTD和陽(yáng)性對(duì)照BDNF（50ng/ml）與10ng/ml濃度的BDNF-PTD對(duì)比，能更加促進(jìn)神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但80ng/ml與100ng/ml濃度的BDNF-PTD之間對(duì)比沒(méi)有差異(P=0.131)，另外，50ng/ml濃度的BDNF-PTD與同等劑量的BDNF對(duì)比，其作用效果相當(dāng)，差

22、異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.660)。
　　 在背根神經(jīng)節(jié)軸突長(zhǎng)度數(shù)據(jù)上，各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.651，P=0.003)，各組藥物能明顯促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)軸突的長(zhǎng)度，50ng/ml，80ng/ml，100ng/ml濃度的BDNF-PTD和陽(yáng)性對(duì)照BDNF(50ng/ml)與10ng/ml濃度的BDNF-PTD對(duì)比，軸突的長(zhǎng)度更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而50ng/ml，80ng/ml，100ng/mlBDNF

23、-PTD與BDNF(50ng/ml)對(duì)促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的效果雖然有一定的差異，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 三、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠局灶性腦缺血預(yù)防治療作用的藥效學(xué)研究
　　 栓塞前給藥6小時(shí)，進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷程度的評(píng)分，各給藥組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯低于模型組和陰性對(duì)照組，各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.914，P=0.000)，進(jìn)行組間多重比較，50μg、100μg給藥組與栓塞

24、組相比，神經(jīng)功能缺陷明顯降低，統(tǒng)計(jì)分析具有顯著差異(P=0.000，P=0.000)，與陰性對(duì)照比較統(tǒng)計(jì)分析也具有顯著差異(P=0.006，P=0.001)，但兩給藥組之間（50μμg100μg）比較沒(méi)有差異(P=0.138)，MCAO與Vehicle沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.481);栓塞后給藥，6小時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷程度的評(píng)分，各給藥組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯低于模型組和陰性對(duì)照組，各組差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.883，P=0.

25、014)，給藥組50μg和100μg組神經(jīng)功能缺陷得分明顯小于模型組，統(tǒng)計(jì)分析有差異(P＜0.05)，但兩組藥物濃度之間神經(jīng)功能缺陷評(píng)分差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.373）;另外，兩組給藥組（50μg、100μg）跟陰性對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P＜0.05），MCAO與Vehicle差異比較沒(méi)有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)
　　 在大鼠大腦局部腦缺血模型制備前腹腔給藥，24小時(shí)后快速斷頭取腦，切片。TTC染色后，對(duì)各組梗死面

26、積百分比進(jìn)行計(jì)算，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.273，P=0.000)，栓塞前給藥組與模型組對(duì)比，給予50μg，100μg蛋白對(duì)大腦梗死具有保護(hù)作用，大腦梗死面積明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩藥物濃度之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000);與陰性對(duì)照組對(duì)比，給予50μg，100μg BDNF-PTD融合蛋白后，大鼠大腦梗死面積明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P＜0.05)。另外在栓塞1小時(shí)后，對(duì)各組梗死面積百分比進(jìn)行計(jì)算，

27、各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=12.433，P=0.000)，兩給藥組大腦梗死面積明顯低于空白模型組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但50μg，100μg兩組之間的大腦梗死面積沒(méi)有差異，統(tǒng)計(jì)分析沒(méi)有意義(P=0.467)，空白模型組與陰性對(duì)照組之間也沒(méi)有差異。
　　 四、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠局部腦缺血治療作用的機(jī)制研究
　　 在PI3K免疫印跡(western blot)結(jié)果灰

28、度分析中，各組之間有差異(F=538.991，P=0.000)，與假手術(shù)，空白模型組栓塞部位，空白模型組非栓塞部位相比，給藥組栓塞部位的PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與同一大腦的給藥組非栓塞部位同樣有差異;另外，給藥組非栓塞部位與假手術(shù)，空白模型組栓塞部位，空白模型組非栓塞部位相比，PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差意義P＜0.01）。在pERK1/2westernblot結(jié)果灰度分析中

29、，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=320.039，P=0.000)，與假手術(shù)，空白模型組栓塞部位，空白模型組非栓塞部位相比，給藥組栓塞部位pERK1/2表達(dá)水平均顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，而與給藥組非栓塞部位無(wú)差異(P=0.957);另外，與假手術(shù)，空白模型組栓塞部位，空白模型組非栓塞部位相比，給藥組非栓塞部位pERK1/2表達(dá)水平也明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而與給藥組栓塞部位差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.

30、957)。
　　 結(jié)論:
　　 一、通過(guò)改良栓線制備局部腦缺血模型，確定了改良栓線的確優(yōu)于傳統(tǒng)的栓線，改良栓線能更好地栓塞大腦中動(dòng)脈，成功率高，具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，因此，改良后的栓線具有更高的應(yīng)用價(jià)值。另外，本部分確定了目前本領(lǐng)域中所存在的兩種缺血再灌注方式對(duì)大鼠局部腦缺血梗死面積、血腦屏障通透性的影響，結(jié)果顯示兩種再灌注方式對(duì)大鼠腦缺血梗死面積，血腦屏障通透性沒(méi)有影響;另外，Group W組更接近臨床生理灌注方式

31、，但這種手術(shù)操作方式困難，不利于模型制備;而Group W組灌注方式不同于生理灌注方式，但其操作方便，利于模型的制備。雖然兩種方式都有自己的優(yōu)勢(shì)，且對(duì)相關(guān)的參數(shù)指標(biāo)沒(méi)有影響，且可互換。但從臨床角度考慮，我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中還是選擇從ECA進(jìn)線制備局部腦缺血再灌注損傷模型。
　　 二、BDNF-PTD融合蛋白，可明顯促進(jìn)大鼠胎鼠背根神經(jīng)節(jié)植塊軸突的生長(zhǎng)。在神經(jīng)節(jié)軸突長(zhǎng)度和生長(zhǎng)范圍（數(shù)量）上與陽(yáng)性對(duì)照組BDNF相比，相同劑量的BDNF-

32、PTD對(duì)促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)軸突長(zhǎng)度和生長(zhǎng)面積沒(méi)有差異。說(shuō)明BDNF經(jīng)過(guò)與PTD重組后得到的融合蛋白具有和BDNF一樣的生物學(xué)活性和功效作用。
　　 三、通過(guò)在大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞前后不同時(shí)間點(diǎn)給藥，以及給予不同的BDNF-PTD劑量，給藥組跟空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，給藥組的腦梗死面積明顯小于模型組和陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外根據(jù)神經(jīng)功能缺陷的評(píng)分，給藥組明顯改善神經(jīng)功能癥狀。通過(guò)上述的實(shí)驗(yàn)可以證明BDNF-PTD能通過(guò)血腦屏障

33、發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，提高神經(jīng)元抵抗缺血的能力，保護(hù)神經(jīng)元和改善缺血后神經(jīng)功能。BDNF-PTD的動(dòng)物試驗(yàn)治療效果為將來(lái)BDNF-PTD應(yīng)用于臨床腦損傷的治療及BDNF-PTD的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 四、實(shí)驗(yàn)證明BDNF-PTD融合蛋白能通過(guò)血腦屏障并且能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，能很好的保護(hù)腦缺血后的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元的生存，其作用的可能機(jī)制，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)BDNF-PTD是激活神經(jīng)元內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化以及在Akt信號(hào)通路中