可通過BBB的BDNF融合蛋白保護腦缺血后神經(jīng)元死亡的藥效學和機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neuotrophic factor，BDNF)是1982年德國神經(jīng)生物學家Barde等首次從豬腦中分離出來的具有防止神經(jīng)元死亡功能的小分子蛋白質(zhì)，它主要由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最具代表性的成員之一。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經(jīng)元的生存、分化、生長和功能起著重要的作用，在病理狀態(tài)下，可促進損傷后神經(jīng)元的修復。例如大腦缺血后，機體

2、在沒有外來因素干預下，內(nèi)源性BDNF可通過自身代償調(diào)節(jié)，提高神經(jīng)元抵抗缺血的能力，促進受損神經(jīng)元的修復、再生，調(diào)節(jié)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建，促進腦損傷后認知功能的恢復。但機體自身的代償能力有限，持續(xù)時間較短，隨著腦缺血時間的延長，內(nèi)源性BDNF表達逐漸降低，同時神經(jīng)細胞損傷后的修復過程及其后的生長必須經(jīng)歷較長時間，內(nèi)源性BDNF及其受體酪氨酸激酶受體(trkB)的上調(diào)尚不足以防治腦缺血性損傷及其以后的細胞死亡。大量實驗表明給予外源性BDNF在抵抗

3、神經(jīng)損傷，促進神經(jīng)元的修復、維持神經(jīng)元的功能等方面的作用已經(jīng)較為肯定。因此，應用外源性BDNF給藥到達大腦發(fā)揮生物學功能將是治療缺血性腦損傷的一個很有潛力的治療方法。但由于血腦屏障的結(jié)構(gòu)特點，限制了血液和腦組織之間的物質(zhì)交換，因此，外源性蛋白很難通過血腦屏障，這也是至今為止，醫(yī)藥市場上幾乎沒有有效的用于預防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的蛋白類藥物。如何解決血腦屏障通透性及腦靶向給藥途徑成為外源性BDNF應用的關鍵，也是醫(yī)藥及相關領域研究者迫切解決

4、和關注的問題。
　　 這就使得臨床上急需一種有效的，非侵入性的方法使腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子通過血腦屏障而發(fā)揮生物學效應，用以滿足BDNF在神經(jīng)退行性疾病方面的預防及治療作用。目前在臨床前試驗研究中試探了許多的給藥方法，主要分為兩類:侵入性和非侵入性。前者主要包括腦血管內(nèi)灌注或腦內(nèi)注射給藥;后者主要采用高分子技術或基因工程技術對BDNF進行修飾，主要有脂質(zhì)體包裹藥物;病毒基因治療的給藥途徑;單克隆抗體偶聯(lián)藥物進行靜脈給藥等。但這些方法

5、存在很多的不足:腦血管內(nèi)灌注或腦內(nèi)注射給藥有極大的不順應性，且給藥后，藥物分布在很小的部位;用脂質(zhì)體包裹藥物能增加藥物的脂溶性，但腦組織對脂質(zhì)體的攝入是絕對的非特異性的，同時也增加了藥物的副作用和成本;病毒基因載體給藥雖然是很好的入腦載體，但并不適合臨床上的急性缺血的腦損傷的治療，因為在腦損傷后很短的時間內(nèi)給藥才能對神經(jīng)元細胞有保護和修復作用，而且病毒載體對人的免疫系統(tǒng)有副作用;單克隆抗體偶聯(lián)藥物進行靜脈給藥能夠使得BDNF通過血腦屏障

6、到達大腦而發(fā)揮生物學效應，但這種方法得到的藥物，過程繁瑣，半衰期短，成本高。如何尋找一種有效的，非入侵性的臨床給藥方法，使得BDNF進入大腦發(fā)揮生物學效應，這是目前我們最為關注和急待解決的問題。
　　 來源于人免疫缺陷病毒的反式轉(zhuǎn)錄激活因子(Transactivator of transcription，TAT)能夠跨膜導入細胞內(nèi)部，具有細胞膜穿透肽(Cell membrane penetratingpeptide，CPP)活性

7、，這一研究發(fā)現(xiàn)給我們解決這個問題提供了很好的思路。蛋白轉(zhuǎn)導域（Protein transduction domain，PTD）是指那些小于20個氨基酸、帶正電荷，可以穿過大多數(shù)細胞膜的穿膜肽(CPP)的一個富含堿性氨基酸區(qū)域，帶正電荷的多肽片段，是行使蛋白轉(zhuǎn)導功能的特殊結(jié)構(gòu)域?？梢詳y帶大分子透過細胞膜進入幾乎所有的哺乳動物細胞內(nèi)，而無需特殊的環(huán)境。另外，穿膜肽對于結(jié)合物的大小沒有嚴格的限制，已經(jīng)在腫瘤，免疫治療等很多臨床前研究中取得了很

8、大的進展，具有廣泛的應用前景。
　　 本課題組在前期研究中，克隆獲得了編碼成熟BDNF-PTD融合蛋白的基因，建立了能表達BDNF-PTD融合蛋白的大腸桿菌細胞系，通過純化和鑒定，得到了BDNF-PTD，前期研究證明BDNF-PTD融合蛋白可通過血腦屏障進入大腦。在此基礎上，本課題將對BDNF-PTD的藥效學進行體內(nèi)外研究，并對其作用機制展開了研究。
　　 目的:
　　 1、制備穩(wěn)定性好、重復性強、成功率高的大鼠

9、局部腦缺血模型。與普通尼龍栓線對比，確定通過石蠟包被后的栓線對于制備的大腦中動脈栓塞局部缺血模型的效果;同時，研究不同損傷再灌注方式對大鼠局部腦缺血模型神經(jīng)功能缺陷、梗死面積、血腦屏障通透性的影響。
　　 2、體外藥效學研究，研究不同劑量的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對體外培養(yǎng)大鼠胎鼠背根神經(jīng)節(jié)軸突生長的影響;并觀察驗證BDNF經(jīng)過與PTD重組后表達，純化得到的融合蛋白是否具有和BDNF一樣的生物學活性和功效。

10、
　　 3、體內(nèi)藥效學研究，研究不同給藥時間，不同給藥劑量BDNF-PTD對大鼠大腦缺血再灌注導致神經(jīng)元損傷的神經(jīng)功能缺陷，缺血梗死面積的影響，觀察BDNF-PTD在腦缺血后對神經(jīng)元的保護作用。
　　 4、研究BDNF-PTD對大鼠大腦缺血再灌注損傷導致神經(jīng)元損傷保護作用的可能機制。
　　 方法:
　　 一、大鼠局部腦缺血模型的制備及其優(yōu)化實驗
　　 用普通尼龍栓線和改良栓線制備大鼠局部腦缺血/再

11、灌注損傷模型。改良栓線制備方法:將尼龍栓線切成70mm，將線頭置于浸滿液體石蠟的0.28mm微管中。等石蠟凝固后，移開微管，為了保持栓線的一致性，最好同一個人制備完成。采用神經(jīng)功能缺陷評分法以及TTC染色法，對比改良線栓與普通尼龍栓線制備大鼠大腦中動脈栓塞模型的效果。另外，通過神經(jīng)功能缺陷評分法，TTC染色法以及伊文思藍染色法分析不同栓塞/再灌注損傷方式對大鼠局部缺血模型神經(jīng)功能缺陷、梗死面積、血腦屏障通透性的影響，并確定在后期實驗中制

12、備模型采取何種方式。
　　 二、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠胎鼠背根神經(jīng)節(jié)軸突生長的影響
　　 在體式顯微鏡下取大鼠胎鼠（E18-20天）背跟神經(jīng)節(jié)，置于6孔板中，4個/孔，隨機分組，陰性對照組（DMEM基礎培養(yǎng)液）、陽性對照組（含BDNF的DMEM基礎培養(yǎng)液，50ng/ml），實驗組（含不同濃度BDNF-PTD的DMEM培養(yǎng)液，10ng/ml，50ng/ml，80ng/ml，100ng/ml），

13、N=3。首先加入300μL相應的培養(yǎng)液，移入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)孵育4h，背根神經(jīng)節(jié)貼壁后，補足相應的培養(yǎng)液至2mL.。48 h后，倒置顯微鏡下觀察軸突生長形狀態(tài)，并拍照。計算最長軸突長度（μm），和軸突的生長面積，各組的軸突生長面積用實驗組與陰性對照組比較的百分比表示，軸突長度用μm表示。所有計量資料數(shù)據(jù)采用(x)±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計學分析軟件分析數(shù)據(jù)。
　　 三、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-

14、PTD)對大鼠局灶性腦缺血預防治療作用的藥效學研究
　　 實驗動物采用隨機數(shù)字表法分為假手術組，空白模型組，給藥組(50μg，100μg)。給藥模型組在栓塞前和栓塞后一個小時腹腔注射BDNF-PTD50μg，100μg，大鼠大腦局部缺血/再灌注24小時快速取腦，用生理鹽水洗去表面的血跡，在-30℃下冷凍10min。冠狀面切片，每片2mm，37℃恒溫箱中2％TTC避光染色10min，然后用多聚甲醛固定24小時。經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫

15、瑰紅色，梗塞區(qū)為白色。然后將固定好的各組大鼠大腦TTC染色切片用Wincats分析軟件對其進行掃描，再用ImageJ軟件計算各組的梗死面積，并進行分析。
　　 四、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠局部腦缺血治療作用的機制研究
　　 實驗動物采用隨機數(shù)字表法分為假手術組，空白模型組，給藥組。給藥模型組在栓塞后一個小時腹腔注射BDNF-PTD50μg，大鼠大腦局部缺血/再灌注24小時后，快速斷頭取腦，將腦

16、組織迅速置于預冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，使用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，此過程在冰上進行。之后通過免疫印跡法檢測大腦中BDNF、P-Erk1/2、Erk1/2、PI3K以及內(nèi)參GAPDH蛋白的表達。所得到的結(jié)果通過Gel-Pro專業(yè)圖像軟件分析。
　　 結(jié)果:
　　 一、大鼠局灶性腦缺血模型的制備及其優(yōu)化實驗
　　 改良后的栓線制備大鼠局部腦缺血模型組（簡稱:cMCAO），其死亡率為0％，成功率為100％;而使用普

17、通尼龍栓線制備大鼠局部腦缺血模型組（簡稱:uMCAO），其死亡率為10％，成功率為55％，其主要原因是由于栓線頭尖銳導致顱內(nèi)出血所致。大鼠大腦中動脈栓塞6小時后，進行神經(jīng)功能缺陷程度的評分，改良栓線組(cMCAO)神經(jīng)功能缺陷評分高于普通栓線組(uMCAO)，組間比較有差異(F=17.292，P=0.01)。通過大鼠CCA進線栓塞大腦中動脈后，12小時斷頭取腦，冠狀切片，TTC染色，結(jié)果顯示在普通栓塞組(uMCAO)中，只有11只大鼠大

18、腦有梗死區(qū)域（2只死亡，7只模型失?。?n=20)，而在改良栓線組(cMCAO)中，所有實驗大鼠都有梗死區(qū)域。軟件分析計算得出cMCAO組的梗死面積大于uMCAO組，其平均梗死面積高于uMCAO組209.97％，組間比較具有差異(F=98.897，P=0.015)。
　　 另外在兩種缺血再灌注方式上，在Group C中，其灌注主要血液來源CCA和ICA，而在Croup W，其主要灌注血液來自Willis環(huán)(除了ICA)，數(shù)據(jù)顯示

19、但Group C評分比group W高，但統(tǒng)計分析結(jié)果顯示兩組動物神經(jīng)功能缺陷無統(tǒng)計學差異(F=1.000，P=0.328)。大鼠栓塞后斷頭取腦，冠狀切片，每片約2mm，TTC染色，結(jié)果顯示group C組大鼠的梗死面積大于group W組大鼠124.79％，但兩組梗死面積差異沒有統(tǒng)計學差異(F=3.5，P=0.075)。
　　 二、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對體外培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)植塊的影響
　　

20、實驗結(jié)果表明，DRG在DMEM基礎培養(yǎng)液條件下，生長緩慢，培養(yǎng)48小時后，神經(jīng)節(jié)軸突仍然沒有明顯生長。而BDNF-PTD共培養(yǎng)后可明顯促進背根神經(jīng)節(jié)軸突的生長。與陰性對照組相比，不同濃度的BDNF-PTD均可使軸突長度增加，生長面積增大。與陽性對照組相比，相同劑量的BDNF-PTDT對促進背根神經(jīng)節(jié)軸突生長和生長面積沒有顯著性差異。
　　 在給藥組中通過軟件分析背根神經(jīng)節(jié)軸突生長面積數(shù)據(jù)，各組比較有統(tǒng)計學差異(F=31.697，

21、P=0.000)，各組藥組能明顯促進背根神經(jīng)節(jié)數(shù)量的生長，50ng/m，80ng/ml，100ng/ml濃度的BDNF-PTD和陽性對照BDNF（50ng/ml）與10ng/ml濃度的BDNF-PTD對比，能更加促進神經(jīng)節(jié)生長，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但80ng/ml與100ng/ml濃度的BDNF-PTD之間對比沒有差異(P=0.131)，另外，50ng/ml濃度的BDNF-PTD與同等劑量的BDNF對比，其作用效果相當，差

22、異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.660)。
　　 在背根神經(jīng)節(jié)軸突長度數(shù)據(jù)上，各組比較有統(tǒng)計學差異(F=11.651，P=0.003)，各組藥物能明顯促進背根神經(jīng)節(jié)軸突的長度，50ng/ml，80ng/ml，100ng/ml濃度的BDNF-PTD和陽性對照BDNF(50ng/ml)與10ng/ml濃度的BDNF-PTD對比，軸突的長度更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而50ng/ml，80ng/ml，100ng/mlBDNF

23、-PTD與BDNF(50ng/ml)對促進軸突生長的效果雖然有一定的差異，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 三、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠局灶性腦缺血預防治療作用的藥效學研究
　　 栓塞前給藥6小時，進行神經(jīng)功能缺陷程度的評分，各給藥組神經(jīng)功能缺陷評分明顯低于模型組和陰性對照組，各組比較有統(tǒng)計學差異(F=9.914，P=0.000)，進行組間多重比較，50μg、100μg給藥組與栓塞

24、組相比，神經(jīng)功能缺陷明顯降低，統(tǒng)計分析具有顯著差異(P=0.000，P=0.000)，與陰性對照比較統(tǒng)計分析也具有顯著差異(P=0.006，P=0.001)，但兩給藥組之間（50μμg100μg）比較沒有差異(P=0.138)，MCAO與Vehicle沒有統(tǒng)計學差異(P=0.481);栓塞后給藥，6小時對動物進行神經(jīng)功能缺陷程度的評分，各給藥組神經(jīng)功能缺陷評分明顯低于模型組和陰性對照組，各組差異比較有統(tǒng)計學意義(F=3.883，P=0.

25、014)，給藥組50μg和100μg組神經(jīng)功能缺陷得分明顯小于模型組，統(tǒng)計分析有差異(P＜0.05)，但兩組藥物濃度之間神經(jīng)功能缺陷評分差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.373）;另外，兩組給藥組（50μg、100μg）跟陰性對照組比較，統(tǒng)計學有差異(P＜0.05），MCAO與Vehicle差異比較沒有有統(tǒng)計學意義(P=1.000)
　　 在大鼠大腦局部腦缺血模型制備前腹腔給藥，24小時后快速斷頭取腦，切片。TTC染色后，對各組梗死面

26、積百分比進行計算，各組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=40.273，P=0.000)，栓塞前給藥組與模型組對比，給予50μg，100μg蛋白對大腦梗死具有保護作用，大腦梗死面積明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，兩藥物濃度之間也有統(tǒng)計學差異(P=0.000);與陰性對照組對比，給予50μg，100μg BDNF-PTD融合蛋白后，大鼠大腦梗死面積明顯降低，統(tǒng)計學有差異(P＜0.05)。另外在栓塞1小時后，對各組梗死面積百分比進行計算，

27、各組比較有統(tǒng)計學差異(F=12.433，P=0.000)，兩給藥組大腦梗死面積明顯低于空白模型組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但50μg，100μg兩組之間的大腦梗死面積沒有差異，統(tǒng)計分析沒有意義(P=0.467)，空白模型組與陰性對照組之間也沒有差異。
　　 四、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠局部腦缺血治療作用的機制研究
　　 在PI3K免疫印跡(western blot)結(jié)果灰

28、度分析中，各組之間有差異(F=538.991，P=0.000)，與假手術，空白模型組栓塞部位，空白模型組非栓塞部位相比，給藥組栓塞部位的PI3K蛋白表達水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與同一大腦的給藥組非栓塞部位同樣有差異;另外，給藥組非栓塞部位與假手術，空白模型組栓塞部位，空白模型組非栓塞部位相比，PI3K蛋白表達水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學差意義P＜0.01）。在pERK1/2westernblot結(jié)果灰度分析中

29、，各組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=320.039，P=0.000)，與假手術，空白模型組栓塞部位，空白模型組非栓塞部位相比，給藥組栓塞部位pERK1/2表達水平均顯著升高，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，而與給藥組非栓塞部位無差異(P=0.957);另外，與假手術，空白模型組栓塞部位，空白模型組非栓塞部位相比，給藥組非栓塞部位pERK1/2表達水平也明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而與給藥組栓塞部位差異無統(tǒng)計學意義(P=0.

30、957)。
　　 結(jié)論:
　　 一、通過改良栓線制備局部腦缺血模型，確定了改良栓線的確優(yōu)于傳統(tǒng)的栓線，改良栓線能更好地栓塞大腦中動脈，成功率高，具有更好的穩(wěn)定性和重復性，因此，改良后的栓線具有更高的應用價值。另外，本部分確定了目前本領域中所存在的兩種缺血再灌注方式對大鼠局部腦缺血梗死面積、血腦屏障通透性的影響，結(jié)果顯示兩種再灌注方式對大鼠腦缺血梗死面積，血腦屏障通透性沒有影響;另外，Group W組更接近臨床生理灌注方式

31、，但這種手術操作方式困難，不利于模型制備;而Group W組灌注方式不同于生理灌注方式，但其操作方便，利于模型的制備。雖然兩種方式都有自己的優(yōu)勢，且對相關的參數(shù)指標沒有影響，且可互換。但從臨床角度考慮，我們在后續(xù)實驗中還是選擇從ECA進線制備局部腦缺血再灌注損傷模型。
　　 二、BDNF-PTD融合蛋白，可明顯促進大鼠胎鼠背根神經(jīng)節(jié)植塊軸突的生長。在神經(jīng)節(jié)軸突長度和生長范圍（數(shù)量）上與陽性對照組BDNF相比，相同劑量的BDNF-

32、PTD對促進背根神經(jīng)節(jié)軸突長度和生長面積沒有差異。說明BDNF經(jīng)過與PTD重組后得到的融合蛋白具有和BDNF一樣的生物學活性和功效作用。
　　 三、通過在大鼠大腦中動脈栓塞前后不同時間點給藥，以及給予不同的BDNF-PTD劑量，給藥組跟空白對照組、陰性對照組相比，給藥組的腦梗死面積明顯小于模型組和陰性組，差異有統(tǒng)計學意義。另外根據(jù)神經(jīng)功能缺陷的評分，給藥組明顯改善神經(jīng)功能癥狀。通過上述的實驗可以證明BDNF-PTD能通過血腦屏障

33、發(fā)揮生物學效應，提高神經(jīng)元抵抗缺血的能力，保護神經(jīng)元和改善缺血后神經(jīng)功能。BDNF-PTD的動物試驗治療效果為將來BDNF-PTD應用于臨床腦損傷的治療及BDNF-PTD的臨床研究奠定了基礎。
　　 四、實驗證明BDNF-PTD融合蛋白能通過血腦屏障并且能發(fā)揮其生物學效應，能很好的保護腦缺血后的神經(jīng)元，促進神經(jīng)元的生存，其作用的可能機制，通過實驗證實BDNF-PTD是激活神經(jīng)元內(nèi)信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化以及在Akt信號通路中