ZGF-130對缺血性神經(jīng)元死亡的保護作用及其機制.pdf

1、腦血管病發(fā)病率高，嚴(yán)重危害人類健康。腦中風(fēng)是最常見的危及生命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也是當(dāng)今第二大死亡原因及首位致殘原因。腦缺血損傷所致的神經(jīng)元大量死亡是導(dǎo)致中風(fēng)后神經(jīng)功能喪失的主要原因，而目前仍未闡明缺血性腦損傷的機制，在尋找治療腦中風(fēng)藥物靶點的同時，預(yù)防和康復(fù)仍是臨床上主要的治療策略。
　　 腦缺血導(dǎo)致的腦損傷一般在缺血后數(shù)小時至數(shù)天發(fā)生，尤其在全腦缺血模型，觀察到海馬CA1錐體神經(jīng)元損傷發(fā)生在缺血后3天左右。而這種腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞

2、的延遲性死亡的發(fā)生發(fā)展涉及多個機制，其中包括凋亡、興奮性毒性、炎癥等。腦缺血中，持續(xù)的腦細(xì)胞的損傷可導(dǎo)致復(fù)雜的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，主要體現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放前炎因子、超氧化物、NO、TNF-α、蛋白酶等神經(jīng)毒性物質(zhì)，這些物質(zhì)都在不同程度地加劇著繼發(fā)性腦損害?，F(xiàn)行認(rèn)為“炎癥”是增強腦缺血后續(xù)損害的主要因素之一。因此，抗炎被認(rèn)為是緩解腦缺血后中樞神經(jīng)損傷的重要策略之一。

3、　　 中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)最主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞擔(dān)任著免疫性炎癥反應(yīng)的角色。小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化對中樞神經(jīng)系統(tǒng)可造成過多的病理損害，適當(dāng)抑制其活化或拮抗其產(chǎn)生的神經(jīng)毒性分子，能減少進一步的細(xì)胞毒作用和病理損害。但干預(yù)治療必需在小膠質(zhì)細(xì)胞活化的早期即組織處于可逆性損傷階段進行。針對此階段而探索到眾多的抗炎藥物均已展示初步的效果。如:膽堿能受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、IL-1拮抗劑、NO抑制劑、中藥、免疫抑制劑、抗絲裂原劑、抗生素等。

4、有研究表明Minozac可穿透血腦屏障，且選擇性抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而顯著提高老年癡呆鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。而ZGF-2-130是Minozac的衍生物?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們采用大鼠全腦缺血模型，探討ZGF-2-130是否能保護腦缺血后海馬神經(jīng)元遲發(fā)性死亡及其機制。
　　 本實驗中全腦缺血再灌注模型均使用230±20g雄性wistar大鼠，參照改良的Pulsinelli四血管閉塞法制作全腦缺血模型[145]。

5、結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血前2h腹腔注射ZGF-2-130低、中、高劑量組（1mg/kg/次，5mg/kg/次，12.5mg/kg/次，2次/天，給藥7天）均有神經(jīng)保護作用，其中低劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)目為46.22±5.29個/mm，高于缺血生理鹽水組19.40±2.43個/mm，結(jié)果有顯著差異(P＜0.05)，與假手術(shù)組(277.57±5.48)相比差異顯著(P＜0.01)。中、高劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)目分別為109.09±10.

6、99個/mm和97.43±8.70個/mm，為原有神經(jīng)元數(shù)目的39.30％和35.10％，與缺血生理鹽水組相比差異顯著(P＜0.01)。此項結(jié)果顯示，全腦缺血再灌注2h前注射不同劑量ZGF-2-130，均有神經(jīng)保護作用，且此保護作用有一定的劑量依賴效應(yīng)。
　　 為了觀察ZGF-2-130是否能抑制缺血再灌注引起的中樞小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，我們按上述給藥方案和時間，缺血前2h腹腔注射不同劑量的藥物后7天，觀察海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的

7、活性。結(jié)果顯示:假手術(shù)組雙側(cè)海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞（0X-42陽性細(xì)胞）反應(yīng)活性微弱，免疫熒光幾乎不可見;缺血生理鹽水組雙側(cè)海馬CA1區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目最多，免疫熒光最強;而給藥低、中、高劑量組均有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，其中、高劑量組抑制效果較明顯。
　　 為了進一步探討ZGF-2-130是否影響星型膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，我們按上述給藥方案和時間，缺血前2h腹腔注射不同劑量的藥物ZGF-2-130后7天，觀察海馬CA1區(qū)星型膠

8、質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)強度和數(shù)目。結(jié)果顯示:假手術(shù)組雙側(cè)海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽性細(xì)胞）數(shù)目平均為24.49±1.27個/mm2，與缺血生理鹽水組（61.80±2.95個/mm2）相比有顯著差異(P＜0.05);即在全腦缺血再灌注7天時，海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目為原有數(shù)目的2.72倍;當(dāng)缺血前2h給予1mg/kg/次、5mg/kg/次和12.5mg/kg/次的ZGF-2-130腹腔注射，2次/天，給藥7天觀察到大鼠海馬CA1區(qū)星形

9、膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目分別為53.63±3.54個/mm2、54.60±2.74個/mm2和55.80±2.88個/mm2。各給藥組和缺血生理鹽水組與假手術(shù)組相比有顯著差異(P＜0.01)，但缺血生理鹽水組和給藥組組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 同時為了證明經(jīng)ZGF-2-130保護后的神經(jīng)元是否仍具有功能，我們采用Morris水迷宮行為實驗，觀察缺血后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變，實驗在缺血后第9天進行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血前2h給予5

10、mg/kgZGF-2-130對大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶有改善的趨勢(P=0.07)。
　　 然而以上這種預(yù)防作用的臨床意義不大，因為考慮在中風(fēng)發(fā)作之前給予藥物保護似乎不現(xiàn)實，目前臨床很難準(zhǔn)確預(yù)測中風(fēng)發(fā)作的精確時機。因此，需探討在缺血后不同時間給予該藥物，觀察其對全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的保護作用。當(dāng)缺血后30min給予5mg/kg/次，ZGF-2-130腹腔注射，2次/天，給藥7天觀察到海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)目

11、為67.06±6.75個/mm，顯著高于缺血生理鹽水組9.38±1.16個/mm，差異顯著(P＜0.01)，為原有神經(jīng)元數(shù)目的24.40％。當(dāng)缺血后6h給予5mg/kg/次，ZGF-2-130腹腔注射，2次/天，給藥7天觀察到海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)目為46.21±4.72個/mm，為原有神經(jīng)元數(shù)目的16.81％，與缺血生理鹽水組比較差異顯著(P＜0.01)?？梢?，全腦缺血再灌注后給予ZGF-2-130腹腔注射，給藥時間越早，治療效果越

12、好。
　　 而缺血后30min給予5mg/kg/次ZGF-2-130腹腔注射，2次/天，給藥7天后，假手術(shù)組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞（OX-42陽性細(xì)胞）數(shù)目平均為23.57±1.47個/mm2;缺血生理鹽水組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目為314.24±8.19個/mm2，即在全腦缺血再灌注7天時，海馬CA1區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目為原有數(shù)目的13.33倍;而給藥組大鼠，海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目為197.25±7.9

13、1個/mm2，為原有小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的8.4倍，即海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增多減少了4.96倍;當(dāng)缺血后6h給予5mg/kg/次ZGF-2-130腹腔注射，2次/天，給藥7天觀察到大鼠海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目為236.51±7.71個/mm2，為原有小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的10.03倍，即海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增多減少了3.3倍。可見，在全腦缺血再灌注模型中，海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目是顯著增多的，缺血后不同時間腹腔注射藥物ZGF-

14、2-130，給藥時間越早，對海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的抑制作用越明顯，至缺血后6h給藥，仍有較為明顯的抑制作用。由此實驗結(jié)果可知，ZGF-2-130對缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目反應(yīng)性增多有顯著的抑制作用。
　　 為了進一步驗證缺血后給予ZGF-2-130是否影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，我們按上述給藥方案和時間，觀察海馬CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞的反應(yīng)強度和數(shù)目。結(jié)果顯示:假手術(shù)組雙側(cè)海馬CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)

15、目平均為31.44±3.09個/mm2，與缺血生理鹽水組（68.89±3.02個/m2）相比有顯著差異(P＜0.01);即在全腦缺血再灌注7天時，海馬CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目為原有數(shù)目的2.3倍;當(dāng)缺血后30min給予5mg/kg/次ZGF-2-130腹腔注射，給藥7天觀察到大鼠海馬CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目為61.63±4.31個/mm2;而缺血后6h給予5mgkg/次ZGF-2-130腹腔注射，給藥7天觀察到大鼠海馬CA1區(qū)G

16、FAP陽性細(xì)胞數(shù)目為60.83±2.55個/mm2。與假手術(shù)組相比，缺血生理鹽水組和給藥組顯著增多(P＜0.05)，但缺血生理鹽水組和給藥組組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。同時我們也探討了ZGF-2-130對海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)的影響，Westernbloting結(jié)果表明缺血/再灌注后GFAP表達(dá)水平上調(diào)，與假手術(shù)組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。缺血/再灌注后30min，6h給藥組GFAP蛋白的表達(dá)水平分別是假手術(shù)組的1.6

17、9，1.72倍，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但與缺血生理鹽水組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)果提示ZGF-2-130對GFAP蛋白表達(dá)無影響。由此實驗結(jié)果可知，ZGF-2-130對缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)無顯著的抑制作用。
　　 為了探討ZGF-2-130是否影響NOS的活性，缺血后30min和6h，分別給予5mg/kg/次，ZGF-2-130腹腔注射，2次/天，給藥7天，結(jié)果表明:海馬CA1

18、區(qū)NADPH黃遞酶陽性細(xì)胞數(shù)目分別為96.61±5.25個/mm和131.10±7.43個/mm，相對于缺血生理鹽水組(149.33±5.31個/mm)顯著降低(P＜0.05)，與假手術(shù)組(50.71±2.14個/mm)相比均有顯著差異(P＜0.01)。可見，全腦缺血再灌注后給予ZGF-2-130腹腔注射，給藥時間越早，NADPH黃遞酶陽性細(xì)胞數(shù)降低的越明顯，對NOS活性的抑制作用越強。
　　 為進一步研究ZGF-2-130抑制

19、小膠質(zhì)細(xì)胞的機制，我們檢測了ZGF-2-130是否影響海馬可誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表達(dá)。RT-PCR結(jié)果表明缺血后3天給藥組iNOS的表達(dá)降低了39.4％(P＜0.05)。
　　 為驗證體內(nèi)結(jié)果，我們也觀察了ZGF-2-130是否對體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞系(BV2)活性和炎癥因子產(chǎn)生影響，利用LPS刺激BV2細(xì)胞建立炎癥模型，首先通過MTT方法觀察ZGF-2-130對BV2細(xì)胞是否有毒性，結(jié)果顯示ZGF-2-13

20、0在0-20nM對細(xì)胞無明顯毒性作用，不影響細(xì)胞活性;但200nM可致細(xì)胞明顯毒性，顯著降低細(xì)胞活性(P＜0.01)。同時也觀察到正常培養(yǎng)的BV2細(xì)胞胞體多數(shù)呈梳狀或桿狀，視野下可見大量細(xì)胞伸出突起;LPS(1ug/ml)可刺激BV2細(xì)胞胞體增大、突起收縮，細(xì)胞多呈球狀;MTT結(jié)果表明ZGF-2-130（0-20nM）也不影響LPS作用后BV2細(xì)胞的活性(P＞0.05)。ELISA和RT-PCR結(jié)果均顯示ZGF-2-130可顯著抑制LP

21、S誘導(dǎo)的IL-1β和TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 大量研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路與炎癥因子的產(chǎn)生密切相關(guān)，為了進一步探索ZGF-2-130抑制炎癥因子產(chǎn)生的機制，我們利用Westernblot觀察ZGF-2-130是否影響p38、ERK、JNK激酶活性，在培養(yǎng)BV2細(xì)胞上探討了ZGF-2-130神經(jīng)保護作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激15min，p38磷酸化水平增高，30min達(dá)最高，隨后逐漸恢復(fù)

22、到正常水平;而ERK、JNK激酶的磷酸化水平則在LPS后呈現(xiàn)持續(xù)性增加，15min達(dá)最高。而給予ZGF-2-130(0.2-20nM)處理后，可顯著抑制p38和ERK磷酸化水平，但對JNK激酶的磷酸化水平無顯著影響。上述結(jié)果提示:ZGF-2-130可能通過抑制p38和ERK活化來抑制炎癥因子的產(chǎn)生。
　　 綜上所述，ZGF-2-130可顯著保護缺血性海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡;其機制之一可能是通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞p38MAPK