中風康對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元保護作用機制研究.pdf

1、河北醫(yī)科大學博士學位論文中風康對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元保護作用機制研究姓名：于文濤申請學位級別：博士專業(yè)：中西醫(yī)結(jié)合臨床指導教師：楊牧祥20060401中文摘要腦梗死體積的測定：動物麻醉，斷頭取腦。腦組織冷凍后間隔lmm連續(xù)冠狀位切片，加入2％的TTC染色，37℃恒溫孵育30min，正常腦組織染為深紅色，腦梗死區(qū)不染色，呈灰白色，再置于2％多聚甲醛磷酸緩沖液固定24h。剝離腦片的梗死區(qū)部分，按文獻用排水法測腦梗死體積。神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)的

2、觀察：大鼠處死后，取右側(cè)大腦額項葉腦皮質(zhì)組織，大小為1mmlmmlmm，立即放入25％戊二醛一多聚甲醛固定24h，1％的四氧化鋨后固定，乙醇逐級脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片，醋酸鈾一檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標準差(i土s)表示，用SPSSforWindows115統(tǒng)計軟件處理，多組比較采用單因素方差分析，然后用StudentNewman—KeulsTest進行每兩組間比較，顯著性差異水平以O05和O

3、0l為標準。第二部分：中風康對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡和相關(guān)基因p53、bcl2表達的影響動物分組同電鏡檢測，用藥情況、模型復制以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法同前，每組取8只大鼠，于造模成功后24h檢測各項指標的變化。凋亡率的檢測：造模成功后24h，迅速斷頭取腦，在冰上切割腦塊，在含有PBS液中研磨，研磨后組織放入離心機中離心10min，取沉淀用PBS稀釋為10ml，反復吹打30次，沉淀5min，取上清lml，經(jīng)400目尼龍網(wǎng)過濾2次，制成單細胞懸

4、液，1000r／min離心10min，取沉淀調(diào)細胞濃度為2106／ml，取1ml細胞懸液加入RNAse(1m∥m1)37℃水浴箱中孵育30min，再次離心10min后將沉淀溶于04mlPBS中，4℃通光條件下進行DNA染色30min。應用流式細胞儀離子激發(fā)光波長488nm，選定每樣本計數(shù)10000個細胞，測量的數(shù)據(jù)應用計算機軟件進行處理，繪制細胞數(shù)與DNA分布圖，計算凋亡率。細胞凋亡率的計算方法：計算10000個細胞中出現(xiàn)的凋亡細胞數(shù)，

5、并計算出百分比。Bcl2、P53蛋白表達的檢測：將1106個細胞以PBs洗滌2次，每次2min，離心2min，棄上清液，加入1：100的鼠抗人Bcl2蛋白單克隆抗體100ul，30℃溫育30分鐘，用PBS離心洗滌2次，棄上清液，加入1：100的羊抗鼠FITC—19G熒光抗體100ul，37℃溫育30min，離心洗滌2次取上清液，除去未結(jié)合的多余熒光抗體，上機前加入1OmlPBS液，經(jīng)400目濾網(wǎng)過濾即可上機檢測。P53蛋白免疫熒光樣品制