甜椒根際合成抗生素假單胞菌遺傳多樣性分析及GP72菌株生防機(jī)制研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室的已有研究表明植物根際合成吩嗪類以及聚酮類抗生素的假單胞菌對植物病原菌起著天然的生防作用.本課題通過在華東地區(qū)六個不同的地點(diǎn)采集甜椒根際土壤樣品,以假單胞菌株 M18 中吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid,PCA)和藤黃綠菌素(Pyoluteorin,Plt)合成基因簇中保守基因?yàn)榉肿犹结?運(yùn)用原位雜交及檢測發(fā)酵產(chǎn)物的方法,從土壤樣品中篩選出48株能夠合成PCA與Plt 的假單胞菌群,大致占了通

2、過King's B(KMB)培養(yǎng)基篩選菌株總數(shù)的0.4﹪.其中合成PCA的菌群(45個)占到了分離菌株總數(shù)的94﹪,分布的地點(diǎn)也相當(dāng)廣泛,而同時合成PCA及Pit的菌群(3個)只占總數(shù)的4﹪,分布范圍也相對比較狹窄,在上述采樣點(diǎn)中沒有發(fā)現(xiàn)單獨(dú)合成Plt的菌株存在.利用限制性片段長度多態(tài)性的分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)方法,根據(jù)該菌群核糖體16S rDNA以及1

3、6S rDNA與23S rDNA之間的間隔區(qū)域(Inter Transcript Space,ITS)的HaeⅢ酶切片段類型,可將所獲得的假單胞菌群分為19種不同的基因型,其中合成PCA的菌群可分為16個不同的基因型.從不同地點(diǎn)基因型的不同分布我們可以看出基因型A5廣泛分布于各個不同的采樣點(diǎn),同時每個采樣點(diǎn)都有彼此不相同的特異基因型分布.從顧莊和馬橋兩地分離得到的合成PCA的菌株分別占了PCA合成菌株總數(shù)的31.1﹪和26.7﹪.在6個

4、采樣點(diǎn)中顧莊和馬橋兩地的甜椒受真菌感染程度最輕,這也從側(cè)面暗示了合成PCA的菌株作為潛在生防菌群起到了一定的生防作用.而且在真菌病害發(fā)生較少的顧莊與馬橋兩地發(fā)現(xiàn)了更多的隸屬于基因型A5的菌株,這也在一定程度上驗(yàn)證了基因型A5在PCA合成菌群中的主導(dǎo)地位以及作為今后進(jìn)一步篩選分離潛在生防菌株的分子遺傳標(biāo)記.隨機(jī)選取每種基因型中的一個菌株為代表,通過對該區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增、測序以及NCBI數(shù)據(jù)庫中的已有序列比對,我們發(fā)現(xiàn)PCA.產(chǎn)生菌群中占主導(dǎo)地

5、位的菌群主要為熒光假單胞菌 (Pseudomonas,fluorescence),惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和嗜麥芽糖假單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia).而同時合成PCA與Plt的菌株主要為熒光假單胞菌與惡臭假單胞菌.除了基因型.A2中的GP36外,那些與熒光假單胞菌和嗜麥芽糖假單胞菌表現(xiàn)出更大相似性的菌株相互之間的相似度在94﹪-99﹪之間,而那些與惡臭假單胞菌遺傳背景更接近的

6、菌株彼此之間的相似度要高一些,基本都在97﹪-99﹪之間.本研究不僅分析了此特殊菌群的遺傳多樣性,同時也為今后篩選新的生防菌株及監(jiān)測田間菌群結(jié)構(gòu)動態(tài)變化提供了一種分子遺傳標(biāo)記. 在菌群生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)上,從潛在的生防菌群(基因型A5)中篩選并鑒定了一株新的具有廣譜抑菌作用的潛在生防菌株.通過詳細(xì)的生理生化指標(biāo)以及遺傳背景的分析,將此潛在生防菌株命名為綠針假單胞菌GP72(Pseudomonaschlororaphis GP72)

7、.對其廣譜抗菌活性的機(jī)制研究表明:該菌株不但能夠分泌促進(jìn)植物生長的一些物質(zhì),例如吲哚-3-乙酸(Indoleacetic Acid, IAA),磷酸酶和蛋白酶,同時還能產(chǎn)生鐵載體來與真菌競爭相應(yīng)的生態(tài)位,更好的定殖于植物根際.通過對其次生代謝物中的抗菌活性物質(zhì)的分離純化鑒定,發(fā)現(xiàn)起主要拮抗作用的兩種吩嗪類抗生素分別為吩嗪-卜羧酸(PCA)與2-羥基-吩嗪(2-hydroxyphenazine,2-OH-PHZ).同時還對不同培養(yǎng)基中該菌

8、株的生長以及抗生素發(fā)酵過程的動態(tài)變化進(jìn)行了跟蹤,并將該菌株與典型的生防菌株綠針假單胞菌30-84(P. chlororaphis 30-84)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化、次生代謝產(chǎn)物以及信號分子的產(chǎn)生規(guī)律的比較,結(jié)果充分表明了該菌株是一株新的潛在生防菌株.甜椒活體的生防實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比目前廣泛使用的化學(xué)農(nóng)藥甲霜靈(25μgml<'-1>),該菌株在一定的起始接種濃度(10<'7>CFU)下對接種辣椒疫霉的甜椒果實(shí)的具有更強(qiáng)的生防作用,對該

9、菌株生防機(jī)制的研究以及甜椒活體的生防試驗(yàn)為田間進(jìn)行更深入的生防應(yīng)用提供良好的基礎(chǔ). 為了克服采用高壓液相法(High Performance Liquid Chromatography,.HPLC)分析次生代謝物過程中存在繁瑣的樣品處理程序、流動相的大量消耗、較長的分離時間以及有機(jī)相的污染問題,本研究試圖運(yùn)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確的定量分析綠

10、針假單胞菌GP72發(fā)酵過程中兩種主要抗生素PCA及2-OH-PHZ的方法.為了減少實(shí)驗(yàn)的操作誤差,引入了吩嗪(Phenazine,PHZ)作為內(nèi)標(biāo).通過對上樣時間及方式、分離電壓、緩沖液pH值和濃度一系列條件的優(yōu)化,確定了分離這兩種吩嗪類抗生素的最佳條件:毛細(xì)管全長為49cm,內(nèi)徑為75μm,外徑為375μm,有效長度為40cm.;10mM,pH7.3磷酸緩沖液:13mbar,10s壓力上樣;毛細(xì)管兩端電壓為25kv;室溫控制在25℃.

11、隨后驗(yàn)證了該方法的特異性、線性相關(guān)性、準(zhǔn)確度、精確度、靈敏度以及最小檢出限和最小定量限.結(jié)果表明2-OH-PHZ與PCA的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9997(n=7)與0.9993(n=7).兩者的遷移時間一直維持在1.62s與1.96s左右.濃度在250μg ml<'-1>-10μg ml<'-1>之間時兩者回收率分別保持在92.56﹪-98.77﹪與91.75﹪-98.35﹪之間,同時兩者的最低檢出限分別為0.47μg ml<'-1>與

12、0.38μg ml<'-1>,而最低定量限分別為1.56μgml<'-1>與1.28μg ml<'-1>.最后成功地運(yùn)用該方法對菌株GP72在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵時的吩嗪類抗生素合成代謝進(jìn)行了跟蹤監(jiān)測. 最后研究了RpoN對菌株GP72發(fā)酵過程中PCA合成代謝以及該菌運(yùn)動性的影響.通過假單胞菌中rpoN基因同源保守區(qū)段的序列比對以及生物信息學(xué)預(yù)測,設(shè)計(jì)引物從菌株GP72基因組中擴(kuò)增出完整包含啟動子區(qū)域的rpoN基因.對rpoN基因進(jìn)

13、行體外突變,雙親雜交以及同源重組,得到了rpoN基因的突變株GP72N.研究表明突變菌株GP72N的生長在不同碳氮源的環(huán)境中受到了不同的抑制,泳動性以及從動性均大大降低,同時吩嗪類抗生素的合成代謝水平也在一定程度上下降了.rpoN基因的互補(bǔ)菌株的各種表形均能恢復(fù)到野生型水平,rpoN基因在野生型菌株中進(jìn)行過表達(dá)并不能顯著地增強(qiáng)該菌株的運(yùn)動性以及吩嗪合成代謝.由此我們可以得出這樣一個結(jié)論:在綠針假單胞菌中RpoN對于菌株的運(yùn)動性以及PCA