阿維菌素生物合成基因簇兩端基因的克隆及測(cè)序分析.pdf

1、聚酮化合物是由多種生物，如細(xì)菌、真菌、或者植物產(chǎn)生的一類(lèi)天然產(chǎn)物。由于具有廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性，聚酮化合物是人類(lèi)醫(yī)療中最重要的一類(lèi)微生物代謝產(chǎn)物，在臨床應(yīng)用中可以作為抗生素、抗癌藥物、低膽固醇劑、抗寄生蟲(chóng)劑、抗真菌劑、殺蟲(chóng)劑以及免疫抑制劑等。其中作為抗寄生蟲(chóng)劑之一的阿維菌素是由除蟲(chóng)鏈霉菌產(chǎn)生的一組由8個(gè)結(jié)構(gòu)相近的同系物組成的16元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，因其極其有效的驅(qū)蟲(chóng)活性，已在獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，具有很高的研發(fā)和商業(yè)價(jià)值。

2、然而，隨著抗性病源菌的日益增多以及阿維菌素對(duì)細(xì)菌和真菌無(wú)抗菌活性的缺點(diǎn)，均促使對(duì)阿維菌素進(jìn)一步地改進(jìn)或者有其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物等新化合物產(chǎn)生。 本實(shí)驗(yàn)為整個(gè)課題的前期工作。根據(jù)除蟲(chóng)鏈霉菌基因組DNA中高GC堿基含量的特點(diǎn)，建立并優(yōu)化了PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的除蟲(chóng)鏈霉菌全基因組序列(GI：57833846)，使用Oligo 6.69軟件，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物averU-A和averU-B以及averL-A和ave

3、rL-B。以除蟲(chóng)鏈霉菌的染色體作為模板，擴(kuò)增獲得了阿維菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之間長(zhǎng)度為1011bp的基因，記作“averU”以及下游aveG和yerD1基因之間長(zhǎng)度為651bp的基因，記作“averL”。分別將基因averU和avgrL與載體連接，構(gòu)建了質(zhì)粒pAVERU和pAVERL。類(lèi)似地，以質(zhì)粒pAVERU作為模板，使用引物averU1-A和averU1-B以及averU2-A和averU2-B，分別擴(kuò)增獲

4、得了長(zhǎng)度為504bp的“averU1”和長(zhǎng)度為507bp的“averU2”兩段目的基因。分別將基因averU1和averU2與載體連接，構(gòu)建了質(zhì)粒pAVERU1和pAVERU2。在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)質(zhì)粒pAVERU1和pUC119_KanR使用限制酶EcoR I和Kpn I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，回收目的基因片段，即小片段averU1和大片段pUC119 KanR(cut)，在T4 DNA連接酶作用下構(gòu)建了重組質(zhì)粒pkAVERU1；采用類(lèi)似的方法