中生菌素生物合成基因zpsA的克隆及功能鑒定.pdf

1、中生菌素(Zhongshengmycin)是由淡紫灰鏈霉菌海南變種(Streptomyceslavendulaevar.hainanensis)合成的N-糖苷類農(nóng)用抗生素，對農(nóng)作物細菌性病害和真菌性病害具有良好的防治效果?！　”狙芯吭谕惪股?諾爾絲菌素、鏈絲菌素)生物合成相關(guān)基因序列已知的基礎(chǔ)上，利用PCR的方法對淡紫灰鏈霉菌海南變種的中生菌素生物合成酶(β-賴氨酸活化酶)基因進行克隆和序列分析，并最終對其功能進行鑒定?！　「鶕?jù)

2、非核糖體肽合成酶A域(腺苷酸化域)氨基酸序列中存在的十個保守區(qū)，并根據(jù)已知的諾爾絲菌素肽合成酶基因(npsA)序列和鏈絲菌素肽合成酶基因(sttA)序列設(shè)計出多條PCR引物，以UV-69菌株的總DNA為模板，先后擴增出四段長度分別為284bp、611bp、370bp和350bp的基因序列，經(jīng)過拼接最終得到1.025kb的中生菌素肽合成酶的基因(zpsA)序列。在GeneBank中進行比對，結(jié)果表明，克隆出的基因與諾爾絲菌素肽合成酶、鏈絲

3、菌素肽合成酶以及非核糖體肽合成酶的基因序列有著很高的同源性，相應基因編碼的蛋白也具有很高的同源性，基因和蛋白的同源性都達到了75％以上。根據(jù)比對結(jié)果，推測zpsA基因編碼的是β-賴氨酸活化酶，與npsA和sttA編碼的蛋白功能相同。具有非核糖體肽合成酶腺苷酸化域的功能(A域)。　　應用基因單交換插入失活的原理，進一步鑒定了zpsA基因的功能。構(gòu)建用于基因破壞的溫度敏感型重組質(zhì)粒pK2(pKC1139：：611bpzpsA)，對中生菌素

4、產(chǎn)生菌淡紫灰鏈霉菌海南變種UV-69菌株原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，39℃培養(yǎng)10天，利用安普霉素抗性篩選，得到了重組的阻斷株。通過PCR的方法初步確定zpsA基因被破壞。將阻斷株進行搖瓶發(fā)酵，測量效價。結(jié)果表明，阻斷株產(chǎn)素效價明顯低于出發(fā)菌株UV-69，說明zpsA基因參與了中生菌素的生物合成，編碼中生菌素生物合成過程中的一個重要酶?！　≡谶M行zpsA基因功能鑒定實驗之前，對UV-69的原生質(zhì)體的再生及轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進行了優(yōu)化。篩選到的最佳條件為：