Streptomyces diastaticus W2中吩嗪生物合成基因簇的研究.pdf

1、鏈霉菌W2和W4是從藥用植物黃花蒿中分離得到的兩株內(nèi)生鏈霉菌，能夠產(chǎn)生兩種二聚化吩嗪類化合物——izumiphenazine C和diastaphenazine，其中diastaphenazine是一種結(jié)構(gòu)新穎、具有抗金黃色葡萄球菌和細(xì)胞毒活性的新型二聚化吩嗪化合物，目前還沒有其生物合成機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。
　　本研究首先對二聚化吩嗪產(chǎn)生菌W2和W4進(jìn)行了背景研究，確定了它們的最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基，分析了它們對不同抗生素的背景抗性以及抑菌譜

2、，推測兩種菌之間具有極其相近的親緣關(guān)系。
　　采用PacBio RSⅡ測序平臺對鏈霉菌W2的基因組進(jìn)行測序分析，獲得一個8，074，405 bp的染色體和三個線性大質(zhì)粒的序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)染色體DNA中含有7993個基因，其中有102個基因與萜類和聚酮化合物代謝相關(guān)，65個基因與其他次級代謝產(chǎn)物的代謝相關(guān)。整個基因組中共有24個次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，其中細(xì)菌素合成基因簇cluster9、鐵載體合成基因簇cluster1

3、2和萜類化合物合成基因簇cluster16與已知的生物合成基因簇沒有相似性，有可能產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。在鏈霉菌W2的基因組中只發(fā)現(xiàn)了一個與吩嗪化合物合成相關(guān)的基因簇cluster17。
　　以pMSB152B為載體構(gòu)建了鏈霉菌W2的cosmid基因組文庫，然后根據(jù)15個小于40 kb的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR篩選基因組文庫，共獲得了67個陽性克隆子。將含有細(xì)菌素合成基因簇cluster9的陽性克隆導(dǎo)入S

4、treptomyces albus中進(jìn)行異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中兩個異源表達(dá)菌株S.albus∷21C7和S.albus∷22A11表現(xiàn)出抑制枯草芽孢桿菌的活性，并且在異源表達(dá)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中找到了可能的代謝產(chǎn)物特征吸收峰。將含有鐵載體合成基因簇cluster12的陽性克隆導(dǎo)入S.albus中進(jìn)行異源表達(dá)，通過HPLC分析也尋找到了可能的代謝產(chǎn)物特征吸收峰。將5個含有吩嗪合成基因簇cluster17的陽性克隆導(dǎo)入S.albus中進(jìn)行異源表達(dá)，