阿維菌素和安絲菌素生物合成相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、阿維菌素是由阿維鏈霉菌(Streptomyces avermtilis)產(chǎn)生的16元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。它具有高效、廣譜的抗各種線蟲和人類寄生蟲的活性，被廣泛地用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的病蟲害防治。
　　avtAB(sav_933、sav_934)是緊鄰阿維菌素生物合成基因簇的兩個基因，它們分別編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的ATP結(jié)合亞基(AvtA)和跨膜亞基(AvtB)。根據(jù)生物信息學的分析，AvtAB極有可能與阿維菌素的外排相關(guān)。本研究構(gòu)建了av

2、tAB的缺失突變株，發(fā)現(xiàn)avtAB的缺失并不能影響阿維菌素的產(chǎn)量。但以野生型菌株NRRL8165和工業(yè)菌株3-115作為出發(fā)菌株構(gòu)建avtAB高表達菌株，固體發(fā)酵時阿維菌素的產(chǎn)量約有一倍左右的提高。avtAB工業(yè)高拷貝菌株(3-115/pJTU3470)在工業(yè)液體培養(yǎng)基中發(fā)酵時，阿維菌素B1a的產(chǎn)量約有50％的提高，可從3.3 g/L提高到4.8 g/L。利用YMG液體培養(yǎng)基定量分析胞內(nèi)胞外阿維菌素產(chǎn)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)avtAB拷貝數(shù)的

3、增加使得胞內(nèi)與胞外阿維菌素B1a的比例從6:1下降到4.5:1。利用Real-time RT-PCR的方法定量分析ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因avtAB、結(jié)構(gòu)基因aveA3和調(diào)節(jié)基因aveR在avtAB高拷貝菌株中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)avtAB的轉(zhuǎn)錄量提高了30-500倍，而aveA3和aveR的轉(zhuǎn)錄量卻沒有明顯變化。這說明avtAB高表達提高阿維菌素的產(chǎn)量是通過及時將其泵出胞外，以減少胞內(nèi)的反饋抑制，而不是在轉(zhuǎn)錄水平激活結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達。此

4、外我們還發(fā)現(xiàn)，AvtAB對于阿維菌素具有底物專一性，avtAB的高表達并沒有影響阿維鏈霉菌中另一種抗生素寡霉素的外排；對鏈霉菌ABC藥物轉(zhuǎn)運蛋白進行進化分析，發(fā)現(xiàn)AvtAB與天藍色鏈霉菌產(chǎn)生的鈣依賴抗生素(CDA)的外排蛋白同源性極高，但在天藍色鏈霉菌中高表達avtAB并沒有明顯提高CDA的產(chǎn)量。
　　aveE基因位于阿維菌素生物合成基因簇的內(nèi)部，它編碼P450單加氧酶，推測其負責催化阿維菌素后修飾的第一步反應(yīng)--C6-C8a位的

5、呋喃環(huán)閉合。為了闡明AveE的功能，深入研究AveE的作用機制，我們首先構(gòu)建了aveE基因中斷突變株，從中分離到了AveE體外催化底物。我們還構(gòu)建了aveE回補菌株和meiE異源回補菌株，發(fā)現(xiàn)aveE和meiE只能恢復阿維菌素A組分，并不能恢復阿維菌素B組分的產(chǎn)生，暗示AveE可能還具有脫去阿維菌素C5位甲基的功能。在獲得AveE可溶蛋白后，我們進行了體外反應(yīng)嘗試，并檢測到了反應(yīng)的發(fā)生，從體外的角度初步證明了AveE具有催化呋喃環(huán)形成的

6、功能。
　　聚酮化合物中常會出現(xiàn)雙鍵位置發(fā)生轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即雙鍵的位置從兩個延伸單位相鄰兩個碳原子之間(α-β位)轉(zhuǎn)移到了前一個延伸單位的兩個碳原子之間(β-γ位)。安絲菌素是從珍貴束絲放線菌橙色變種(Actinosynnema pretiosum ssp.auranticum)ATCC31565中分離到的安莎類抗生素。安絲菌素生物合成的第2和第3個模塊中的脫水酶結(jié)構(gòu)域(AsmDH2、AsmDH3)所對應(yīng)催化的雙鍵都發(fā)生了α-β位向

7、β-γ位轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象。本研究通過定點突變失活了AsmDH2和AsmDH3，但定點突變株不能積累安絲菌素的完整延伸產(chǎn)物，說明下游酮脂酰-ACP-合成酶(KS)具有嚴格的底物嚴謹性，不能催化非天然的三酮或四酮中間產(chǎn)物。另外，我們還構(gòu)建了將紅霉素硫酯酶(EryTE)基因融合加載在安絲菌素模塊2之后的突變株，結(jié)果顯示EryTE并不能高效釋放三酮中間產(chǎn)物，安絲菌素中間產(chǎn)物的體內(nèi)捕獲具有一定的難度。體外表達安絲菌素模塊2，將約200 kDa的可溶蛋白