燃煤型地方性氟中毒病區(qū)學(xué)齡兒童智力和慢性氟中毒仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變及干預(yù)研究.pdf

1、目的：地方性氟中毒（簡(jiǎn)稱地氟?。┦鞘澜缟戏植驾^為廣泛、危害較為嚴(yán)重的一種地方病，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷，導(dǎo)致病區(qū)兒童智力低下。但慢性氟中毒對(duì)發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)損傷作用機(jī)制目前還未完全闡明清楚。為了解燃煤型地方性氟中毒病區(qū)經(jīng)過(guò)綜合治理后學(xué)齡兒童智力情況我們進(jìn)行了此次調(diào)查，并通過(guò)動(dòng)物模型和細(xì)胞模型進(jìn)一步探討腦組織中 N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸( N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體、鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)通路及氧化應(yīng)激對(duì)慢性氟中

2、毒仔代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶能力的損害作用。應(yīng)用抗氧化劑維生素 E（Vit E）進(jìn)行干預(yù)處理，尋找慢性氟中毒有效防治措施。
　　方法：選擇貴州省畢節(jié)市典型燃煤型地方性氟中毒病區(qū)改爐改灶及健康教育綜合治理時(shí)間超過(guò)3年的村8-12歲小學(xué)生作為治理時(shí)間長(zhǎng)組，綜合治理時(shí)間<1年的村小學(xué)生作為治理時(shí)間短組，同時(shí)選擇畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)內(nèi)同年齡段小學(xué)生作為對(duì)照組。采用Dean法進(jìn)行氟斑牙檢查，氟離子選擇電極法測(cè)定尿氟，《瑞文標(biāo)準(zhǔn)推理測(cè)驗(yàn)》檢測(cè)智商。

3、通過(guò)飲水加氟和 Vit E灌胃處理制備動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理5個(gè)月后雌雄大鼠合籠，分別取出生1、7、14、21、28 d仔鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。觀察仔鼠出生后體重變化；記錄仔鼠完成平面翻正、空中翻正、聽(tīng)覺(jué)驚愕、斷崖回避等神經(jīng)反射的時(shí)間； Morris水迷宮檢測(cè)仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力；HE和尼氏染色觀察仔鼠腦組織形態(tài)改變；腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)通過(guò)相關(guān)試劑盒檢測(cè)；免疫組化方法檢測(cè)神經(jīng)元核心抗原Neu N，NMDA受體各亞單位（NR1、NR2A、NR2B、NR

4、3A）、CaMK II蛋白在腦組織的表達(dá)定位；Western-blotting和 Real-time PCR方法檢測(cè)大鼠腦組織和體外培養(yǎng)細(xì)胞中 NMDA受體各亞單位蛋白及 mRNA表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)仔鼠腦組織和體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率；激光共聚焦和流式細(xì)胞儀觀察體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）和鈣離子（Ca2+）熒光染色。
　　結(jié)果：與對(duì)照組兒童比較，病區(qū)兒童氟斑牙檢出率和兒童尿氟含量顯著升高，且治理時(shí)間短組檢出率高于治理

5、時(shí)間長(zhǎng)組。智力調(diào)查結(jié)果顯示，病區(qū)兒童智商與對(duì)照組比較明顯下降，且智商分布與尿氟含量呈負(fù)相關(guān)。病區(qū)治理時(shí)間長(zhǎng)與治理時(shí)間短兩地兒童的智商分布從整體和性別比較無(wú)差異，但在低年齡組兒童中，治理時(shí)間長(zhǎng)病區(qū)兒童中等以上智商比例高于治理時(shí)間短病區(qū)兒童。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組仔鼠出生體重?zé)o顯著差異，但染氟組仔鼠體重增長(zhǎng)緩慢，至出生28 d體重明顯低于對(duì)照組和Vit E干預(yù)組；完成平面翻正、空中翻正的時(shí)間延遲，水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示逃避潛伏期延長(zhǎng)

6、，探索平臺(tái)次數(shù)減少，學(xué)習(xí)記憶能力下降。HE染色觀察隨仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育，海馬及神經(jīng)細(xì)胞體積增大，染氟組仔鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞核比例增大、染色增強(qiáng)；神經(jīng)細(xì)胞尼氏染色變淺；神經(jīng)元核心抗原 Neu N表達(dá)降低；腦組織細(xì)胞凋亡率增高；腦組織 SOD活力下降，MDA含量增加，NO和NOS均呈增高趨勢(shì)。Vit E干預(yù)組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NMDA受體各亞單位在仔鼠發(fā)育進(jìn)程中表達(dá)情況為：與新生仔鼠蛋白表達(dá)比較，對(duì)照組 NR1蛋白表達(dá)于出生后2

7、1 d達(dá)高峰，以后逐漸下降；NR2A亞基于出生14 d表達(dá)明顯升高，并維持至出生后28 d；NR2B亞基蛋白表達(dá)于出生28 d時(shí)明顯升高；NR3A亞基在仔鼠出生14 d表達(dá)最高；phospho-NR2B在仔鼠出生14 d表達(dá)升高，并穩(wěn)定維持至出生后28 d；CaMK II于出生14 d表達(dá)明顯升高，之后有緩慢下降。染氟組 NR1亞單位在仔鼠出生后7 d升高，之后逐漸下降至新生水平；NR2A亞基于出生28 d表達(dá)量最高；NR2B在仔鼠出生

8、14 d時(shí)其表達(dá)顯著增加，至出生后28 d稍有下降；NR3A亞基表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；phospho-NR2B在仔鼠出生14 d出現(xiàn)表達(dá)升高，并在出生21 d、28 d表達(dá)顯著升高；CaMK II蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化。Vit E干預(yù)組 NR1亞基表達(dá)高峰出現(xiàn)在出生后第14天，持續(xù)至出生后28 d；NR2A蛋白表達(dá)于出生后21 d達(dá)最高；NR2B亞基蛋白在仔鼠出生14 d時(shí)其表達(dá)顯著增加；NR3A亞基蛋白在仔鼠出生7 d表達(dá)上升，14 d時(shí)達(dá)

9、高峰，一直維持至出生28 d；phospho-NR2B蛋白在出生14 d后表達(dá)升高；CaMK II蛋白在Vit E處理組仔鼠出生后7 d其表達(dá)就升高，維持至出生28 d。與對(duì)照組及 Vit E處理組同齡仔鼠各亞單位蛋白表達(dá)比較，染氟組仔鼠腦組織NR1、 NR2B及phospho-NR2B蛋白表達(dá)升高，CaMK II、 NR3A亞基蛋白的表達(dá)下降，NR2A蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。仔鼠腦組織中 NMDA各亞單位 mRNA表達(dá)水平隨仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育，

10、染氟組NR1和NR2b mRNA表達(dá)水平有所升高，21d表達(dá)最高，28 d表達(dá)逐漸下降；NR3a mRNA表達(dá)下降；Vit E干預(yù)組 NR3a mRNA表達(dá)升高。
　　本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)了原代神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)加氟處理后，隨染氟時(shí)間增加，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞內(nèi) ROS和 Ca2+熒光染色增強(qiáng)，NMDA受體中 NR1、 NR2B、phospho-NR2B蛋白表達(dá)升高，NR2A表達(dá)無(wú)明顯改變，NR3A及 Ca MKII表達(dá)下降。轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)發(fā)現(xiàn)

11、，低劑量氟處理時(shí)，NMDA各亞單位基因的表達(dá)無(wú)明顯變化，高濃度氟處理后，NR2B mRNA表達(dá)升高，NR3A mRNA表達(dá)下降。通過(guò)抗氧化劑 Vit E預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡下降，細(xì)胞內(nèi) ROS熒光強(qiáng)度明顯下降，Ca2+熒光強(qiáng)度也有一定降低。
　　結(jié)論：以上研究結(jié)果表明，（1）地方性氟中毒病區(qū)學(xué)齡兒童氟中毒情況仍較重，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間綜合治理后的病區(qū)兒童氟斑牙及尿氟含量下降，低年齡兒童智力明顯改善。（2）慢性氟中毒可對(duì)仔代生長(zhǎng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)