兔干眼模型的建立及FK506治療干眼的療效及作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分皮下注射氫溴酸東莨菪堿建立兔干眼模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:探討兔皮下注射氫溴酸東莨菪堿,建立干眼模型的特點(diǎn)和眼表病理損害機(jī)制。
　　 方法：健康新西蘭大白兔18只,隨機(jī)分為三組,每組6只。實(shí)驗(yàn)組皮下注射氫溴酸東莨菪堿,其中低劑量組(L,1.0mg/次)、高劑量組(H,2.0mg/次),對照組注射等量生理鹽水。注射時(shí)間點(diǎn)為每天8點(diǎn)11點(diǎn)、14點(diǎn)和18點(diǎn),連續(xù)30天。用藥后0、7,14,21,30d對實(shí)驗(yàn)組及對照組

2、行淚液分泌試驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間(BUT)、角膜熒光素染色,印跡細(xì)胞檢查。第30d空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)動物,取角膜、結(jié)膜及淚腺組織行HE染色,免疫組化檢測FAS,BCL-2及NFκB)的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：酚紅棉線法測得高劑量(H)組造模前淚液分泌量為16.25±2.299mm,第21d時(shí)下降為6.75±1.982mm.,對照組為16.50±2.619mm,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),同期低劑量組(L)為15.00±2.3

3、90mm,與對照組相比無明顯差異。H組第3d出現(xiàn)BUT縮短,L組則第7d發(fā)生BUT的變化,此后BUT值均低于5s,對照組BUT大于20s。實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)角膜熒光素染色陽性,H組出現(xiàn)時(shí)間早(3d),持續(xù)時(shí)間長。L組和H組PAS染色與對照組相比,杯狀細(xì)胞形態(tài)紊亂、核淡染,部分核固縮,L組和H組之間無明顯差異。HE染色顯示H組淚腺周圍見散在淋巴細(xì)胞和腺腔凋亡性改變,角膜上皮呈重度瘤樣增生基質(zhì)層變性伴水腫,結(jié)膜杯狀細(xì)胞反應(yīng)性增多,固有層見淋巴細(xì)胞

4、浸潤數(shù)量增加。L組角膜淺層上皮輕度增生,細(xì)胞排列稍紊亂,結(jié)膜和淚腺組織病理改變輕微。電鏡觀察高劑量組淚腺腺管管腔壁絨毛較對照組明顯減少,角膜表層微絨毛較對照組減少,上皮細(xì)胞空泡變,細(xì)胞核固縮,結(jié)膜表面微絨毛減少,上皮細(xì)胞呈壞死凋亡改變,低劑量未見明顯顯微改變。凋亡抑制因子BCL-2在高劑量模型組淚腺、角膜和結(jié)膜組織中極少表達(dá),對照組各組織均呈高度陽性表達(dá),兩組差異顯著p<0.001；促凋亡因子Fas在模型組淚腺組織中呈中度表達(dá),在角膜和

5、結(jié)膜組織中呈中高度表達(dá)。炎癥轉(zhuǎn)錄因子NFκB在模型組兔眼淚腺腺泡細(xì)胞胞漿和胞核輕度表達(dá),腺腔管壁細(xì)胞胞核和胞漿中重度表達(dá),角膜組織上皮細(xì)胞和基底細(xì)胞胞漿、胞核以及結(jié)膜上皮細(xì)胞中NFκB呈中度陽性表達(dá),對照組各組織NFκB極少表達(dá),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。
　　 結(jié)論：兔皮下注射氫溴酸東莨菪堿,4次/天,2.0mg/次,可有效維持藥物外周濃度,抑制淚腺的分泌,引起角結(jié)膜上皮細(xì)胞的損傷以及角結(jié)膜上皮和淚腺組織細(xì)胞凋亡

6、因子和炎癥因子陽性表達(dá)增加,成功建立以淚液缺乏為主,凋亡和炎癥反應(yīng)共同參與的干眼動物模型。
　　 第二部分 FK506對氫溴酸東莨菪堿至兔干眼模型的療效
　　 目的:觀察FK506滴眼液干預(yù)兔干眼模型的療效及其作用機(jī)制
　　 方法：健康新西蘭大白兔30只,隨即分為實(shí)驗(yàn)組18只和對照組12只。實(shí)驗(yàn)組采用上述方法每天8點(diǎn)11點(diǎn)、14點(diǎn)和18點(diǎn)皮下注射氫溴酸東莨菪堿注射液2.0mg/次,并從第四天開始左眼點(diǎn)0.05％F

7、K506滴眼液,4次/天,右眼不做處理,對照組皮下注射生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第0,3,7,14,21,35d對實(shí)驗(yàn)組及對照組行淚液分泌試驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間(BUT)、角膜熒光素染色檢查。分別在第7,14,和35d采取空氣栓塞法分別隨即處死模型組5只兔子,取雙眼角膜、結(jié)膜和淚腺組織,PCR定量分析IL-1β、TNF-α和MMP-9等炎性因子在各組織的表達(dá)。第35d采用印記細(xì)胞學(xué)方法取雙眼角結(jié)膜上皮細(xì)胞行免疫組化檢測NFκB表達(dá)水平的差異。
　

8、　 結(jié)果：造模后3,7天實(shí)驗(yàn)兔雙側(cè)眼均角膜熒光素染色強(qiáng)陽性。第14d開始FK506治療眼角膜熒光素染色評分低于未用藥眼,至第35d,差異進(jìn)一步增大具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。FK506治療組眼的角結(jié)膜上皮NFκB表達(dá)顯著低于對照眼,不同時(shí)間點(diǎn)治療組結(jié)膜組織中IL-1β、TNF-α和MMP-9表達(dá)水平低于對照組,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。14天時(shí)雙側(cè)淚腺M(fèi)MP-9水平造模后與對照組相比呈現(xiàn)增高,但用藥干預(yù)眼與未治療眼之間