HBV核心抗原與前S1抗原基因的融合表達(dá)及其對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫治療作用.pdf

1、研究背景 乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范圍內(nèi)流行，全球大約30％的人口感染HBV，每年至少有100萬(wàn)慢性感染的病人死于慢性肝臟疾病，包括肝硬化和肝癌。我國(guó)有1.2億乙型肝炎表面抗原攜帶者，有2000萬(wàn)慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)病人。尋找治療慢乙肝、慢性病毒攜帶者的治療方法是急需解決的問(wèn)題。 目前用于慢乙肝治療的藥物豐要有抗病毒藥物和免疫機(jī)能調(diào)節(jié)藥，前者包括核苷酸類似物如拉米呋啶，后者包括胸腺肽和左旋咪唑以及具有抗病

2、毒作用的干擾素。這些藥物不儀效果不盡人意，而且價(jià)格昂貴，副作用大。隨著對(duì)乙肝發(fā)病機(jī)理研究的深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到宿主對(duì)HBV的免疫耐受是慢乙肝發(fā)病的關(guān)鍵。利用含HBV表面抗原和核心抗原基因的疫苗免疫能有效的激活機(jī)體的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫。治療性疫苗可能成為慢乙肝治療的新突破。 比較早已熟知用于乙肝預(yù)防免疫的HBV表面抗原(HBsAg)疫苗，近年來(lái)人們對(duì)HBV核心抗原(HBcAg)在HBV免疫中的地位越來(lái)越重視。現(xiàn)已證明HBcA

3、g在自限性HBV感染病人中是一個(gè)Th細(xì)胞的重要靶子，而在慢性HBV感染病人中這種針對(duì)HBcAg的Th細(xì)胞反應(yīng)很低或消失。用編碼HBcAg的DNA疫苗免疫小鼠可激發(fā)MHC-I類限制性CTL，從而參與病毒的清除。乙型肝炎病毒對(duì)肝細(xì)胞受體的相應(yīng)配體存在于前S1(21～47)氨基酸多肽部分，前S1蛋白的免疫原性比HBsAg為強(qiáng)，因此提示前S1/前S2可能具有改進(jìn)現(xiàn)用疫苗的保護(hù)性。 研究目的 1、表達(dá)可用于乙型肝炎治療性疫苗研究的

4、乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)與前S1抗原(PreS1)氨基酸(AA)3—55肽段融合蛋白(HBVCS1)。 2、觀察融合蛋白抗原HBVCS1誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答情況。 3、觀察融合蛋白疫苗HBVCS1在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫治療效果。 研究方法 1、以原核表達(dá)載體pET-lld表達(dá)HBV融合蛋白，采用免疫印跡技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析表達(dá)產(chǎn)物的抗原性。 2、實(shí)驗(yàn)組和

5、對(duì)照組小鼠(Balb/c)，分別腹腔內(nèi)注射融合蛋白抗原HBVCS1與免疫佐劑(弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑)，對(duì)照組小鼠儀注射弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。采用酶連免疫吸附方法檢測(cè)抗原接種前后血清中抗-HBc及其亞類和抗-PreS1。 3、16只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠分成兩組，在0周和3周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔內(nèi)注射HBVCS1與免疫佐劑(弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑)，對(duì)照組儀注射弗氏完全佐劑與磷酸鹽緩沖液PBS。采用<'3>H-TdR摻

6、入法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠脾淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中的乙肝病毒表面抗原HBsAg，采用熒光定量PCR檢測(cè)血清中的HBVDNA。 結(jié)果 1、HBV融合蛋白在大腸桿菌中有效穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有核心抗原和前S1特異抗原性。 2、實(shí)驗(yàn)組小鼠有高滴度的抗-HBc 和抗-PreS1產(chǎn)生，隨免疫時(shí)間增長(zhǎng)，抗-HBc滴度與抗原量正相關(guān)(P<0.05)，與佐劑(弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑)的使用無(wú)關(guān)(P>0.

7、05)。對(duì)照組無(wú)特異性抗體產(chǎn)牛。在所抗-HBc IgG亞類中，以IgG2a占優(yōu)勢(shì)(IgG2a/IgG1>1)，提示小鼠在免疫后均傾向于產(chǎn)生。IgG2a占優(yōu)勢(shì)的Th1型輔助性T細(xì)胞應(yīng)答。 3、實(shí)驗(yàn)組(1.99±0.347)轉(zhuǎn)基因鼠脾細(xì)胞抗原特異性增殖反應(yīng)明顯高于對(duì)照組(1.56±0.149)；實(shí)驗(yàn)組第6周(3.58±0.80)與第9周(3.45±0.70)血清中HBsAg終點(diǎn)滴度與第 1 周(4.36±1.04)及第3周(4.81

8、±0.98)以及同一時(shí)間實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間HBsAg終點(diǎn)滴度均有顯著性差別；實(shí)驗(yàn)組小鼠第6周(4.02±0.29)和第9周(3.58±0.17)血清中HBVDNA含量明顯低于免疫前(5.55±0.88)，而對(duì)照組各批血清無(wú)此差別。 結(jié)論 1、方法有效表達(dá)了HBV融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物具有特異抗原性。融合蛋白的表達(dá)為進(jìn)一步進(jìn)行HBVCS1融合蛋白作為疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。 2、乙型肝炎病毒核心前S1融合蛋白抗原對(duì)小鼠很好