豬流行性腹瀉抗原基因COE的原核表達與純化.pdf

1、豬流行性腹瀉病(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猜流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引發(fā)的一種腸道傳染病，自從該病在我國流行以來，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失。豬場主要通過日常消毒和接種疫苗來預防該病，但日前在市場上流行的疫苗并不能到達理想的免疫效果。研究表明仔豬主要通過初乳獲得母源SIgA（分泌型免疫球蛋白A）產(chǎn)生對PEDV的被動免疫保護，血液中

2、循環(huán)的IgG抗體不能對仔豬產(chǎn)生有效的保護，非經(jīng)腸道黏膜免疫不能獲得SIgA，因此通過腸道黏膜免疫是使仔豬獲得免疫保護的重要途徑，研制安全有效可以通過腸道黏膜免疫的新型疫苗尤為重要。
　　S蛋白是由S基因編碼的PEDV一個表面結構蛋白，電是PEDV的主要結構蛋白，它含有介導病毒侵入宿主細胞的受體結合域，還含有介導機體產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原表位。有可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體和提供黏膜免疫保護的作用。COE抗原表位是S基因中的一個重要抗原

3、表位，是由chang等人發(fā)現(xiàn)并命名的，這個抗原表位位于S基因的499-638aa區(qū)域。自從COE抗原表位被發(fā)現(xiàn)后世界各國學者均嘗試應用COE抗原表位基因研究制備PEDV的基因工程疫苗。
　　本實驗是研究PEDV主要抗原決定簇COE的原核表達與純化，為研制新型的豬流行性腹瀉病毒疫苗奠定基礎。
　　本實驗首先從河南本地的疑似得豬流行性腹瀉病的病豬小腸分離出PEDV，然后根據(jù)GenBank發(fā)表的PEDV-COE序列設計出一對引物，

4、用PCR的方法擴增出長度為420bp的COE目的片段。將目的片段連接在載體PMD19-T上，然后轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌中，涂板過夜生長，挑菌接種到液體LB中培養(yǎng)擴增、提質(zhì)粒，鑒定正確后送公司測序，將測序結果與GenBank公布的最相近的4個PEDV-COE序列做比較，發(fā)現(xiàn)河南本地PEDV發(fā)生了一定的突變，與河南周邊地區(qū)的毒株具有一定的差異。將COE基因片段連接至PET-32a載體上構建原核表達載體PET-32a-COE，鑒定正確后將表

5、達載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS大腸桿菌中。為了探索最佳的誘導條件，我們對IPTG誘導的濃度和時間進行了優(yōu)化，結果顯示0.6mmol/L的IPTG誘導4h能夠得到最大量的目的蛋白。我們將誘導表達目的蛋白的大腸桿菌經(jīng)超聲破碎、經(jīng)鎳株蛋白純化試劑盒純化，透析復性，最后得到了HIS-COE目的蛋白。HIS-COE目的蛋白的成功表達與純化為制備能夠預防在本地區(qū)流行的PEDV的新型疫苗提供了參考，對PEDV基因工程疫苗的研究與制備也具有重