前列腺特異膜抗原基因的克隆與表達(dá).pdf

1、【背景】該實(shí)驗(yàn)獲得了有效的腫瘤抗原靶基因,為研究基因轉(zhuǎn)染的DCs疫苗提供了必需的條件.【目的】構(gòu)建PSMA真核表達(dá)系統(tǒng),為基因修飾的前列腺癌DC s疫苗提供物質(zhì)基礎(chǔ).【方法】從前列腺癌組織中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為c DNA.根據(jù)Ge nebank上的PSMA序列(M99487)設(shè)計(jì)一對含BamHl和Xhol酶切位點(diǎn)的引物,PCR擴(kuò)增cDNA.PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3分別經(jīng)雙酶切后凝膠回收純化,用T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化用氯化鈣法

2、制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5 α.從氨芐青霉素陽性的LB轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取單菌落,增菌并提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定,含有目的片斷的為陽性重組子,采用自動序列分析儀對PSMA-pcDNA3插入片段進(jìn)行序列測定.采用無菌操作提取并純化PSMA-pcDNA3質(zhì)粒,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞系PC-3,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用G418 300μg/ml選擇培養(yǎng)基培養(yǎng),對G418抗性克隆用RT-PCR方法篩選鑒定陽性克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆,獲

3、得穩(wěn)定生長并表達(dá)PSMA目的蛋白的陽性克隆細(xì)胞株,200 μ g/ml維持篩選.用間接免疫熒光法檢測轉(zhuǎn)染表達(dá)PSMA蛋白在細(xì)胞中的位置.提取細(xì)胞總蛋白,用Western Blotting法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)PSMA蛋白的分子量.【結(jié)論】1.利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了PSMA編碼區(qū)cDNA,經(jīng)序列分析顯示擴(kuò)增片斷的序列正確.2.構(gòu)建了PSMA真核表達(dá)載體,建立了穩(wěn)定表達(dá)PSMA的細(xì)胞株.3.經(jīng)免疫分析,證實(shí)了真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的PSMA為分