神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的探討神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemce¨s，NSCs)移植修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的可行性，為建立促進(jìn)周圍神經(jīng)再生新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法①建立NSCs體外培養(yǎng)模型：分別取胚胎(E12)和新生(出生1d)SD大鼠的大腦皮層分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察和Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，以及BrdU(5．溴脫氧尿核苷)法檢測細(xì)胞增殖能力，并對其分化后的細(xì)胞檢測成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志抗原MAP2和GFAP。②建立雪旺細(xì)胞(Schwanncel1s

2、，SCs)體外培養(yǎng)模型：分別取新生和成年SD大鼠的坐骨神經(jīng)，用混合酶消化法、差速貼壁法和低濃度胰酶快速消化法進(jìn)行培養(yǎng)和純化，通過形態(tài)學(xué)觀察和S㈣免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，并行MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。③研究NSCs與幾丁質(zhì)膜、明膠海綿的生物相容性：從胚胎鼠大腦皮層獲得的NSCs與幾丁質(zhì)膜、明膠海綿在有血清和無血清的不同條件下聯(lián)合培養(yǎng)，觀察NSCs生長情況及形態(tài)變化，并對其進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。④NSCs移植修復(fù)周圍神經(jīng)缺損：45只SD大鼠，將其

3、坐骨神經(jīng)切除后造成12mm神經(jīng)缺損模型，用幾丁質(zhì)膜和明膠海綿橋接，隨機(jī)分成3組，每組15只。在幾丁質(zhì)膜管中分別植入：A：胚胎鼠BrdU—NSCs；B：新生鼠BrdU—SCs；C：生理鹽水，為空白對照組。術(shù)后4w、8w、12w，各組分別通過大體觀察、神經(jīng)電生理、組織學(xué)檢查再生神經(jīng)組織，并對NSCs、SCs移植后的存活情況進(jìn)行檢測。 結(jié)果①胚胎和新生大鼠NSCs培養(yǎng)、分化特點(diǎn)：取自胚胎和新生大鼠大腦皮層的細(xì)胞均呈現(xiàn)NSCs克隆球形態(tài)

4、，表達(dá)NSCs特異性標(biāo)志蛋白Nestin，并具有自我更新及體外擴(kuò)增傳代能力，可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但兩組細(xì)胞的Nestin及BrdU陽性率均有顯著性差異(P<0．05)。②新生和成年大鼠SCs培養(yǎng)、純化特點(diǎn)：新生和成年大鼠SCs生長狀態(tài)良好，均呈S100免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)陽性，純度均達(dá)95％以上，由生長曲線顯示新生鼠SCs生長更快，第2代SCs倍增時間：新生鼠3d、成年鼠4d。③NSCs與幾丁質(zhì)膜、明膠海綿的生物相容性：NS

5、Cs接種至幾丁質(zhì)膜和明膠海綿后，在NSCs選擇培養(yǎng)基中NSCs球往往粘附在幾丁質(zhì)膜上，仍能保持球形生長的特性，呈Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)陽性；在NSCs分化培養(yǎng)基中可見到大量的細(xì)胞從神經(jīng)球周邊遷出，分化成各種神經(jīng)細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光染色結(jié)果提示大部分細(xì)胞為MAP2陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的星型膠質(zhì)細(xì)胞，極少數(shù)S100陽性的SCs樣細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞難以檢測到。④NSCs移植術(shù)后存活情況的檢測及再生神經(jīng)組織的檢查：術(shù)后8w再生

6、神經(jīng)免疫組化檢測仍觀察到有存活的NSCs、SCs，且NSCs存活數(shù)量多于SCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；術(shù)后各時間點(diǎn)，大體觀察、坐骨神經(jīng)一肌肉復(fù)合動作電位的波幅(AMP)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)、再生軸突的數(shù)目和直徑、髓鞘的厚度比較，A組均優(yōu)于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。 結(jié)論①胚胎鼠NSCs數(shù)量多且增殖能力強(qiáng)，新生鼠SCs生長快且增殖能力強(qiáng)，二者更適合作為神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞。②幾丁質(zhì)膜、明膠海綿對