糖尿病早期視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞病變及其對(duì)血視網(wǎng)膜屏障的影響.pdf

1、本文對(duì)糖尿病早期視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞病變及其對(duì)血視網(wǎng)膜屏障的影響進(jìn)行了探討,主要內(nèi)容有: 1、STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的建立及早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜GFAP和(3ccIudin表達(dá)的變化 目的：研究糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白和膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的改變。 方法：按60mg/kg一次性大鼠腹腔注射STZ，3d后測血糖¨．0mmo!A以上為造模成功。用免疫熒光法和免疫印跡法分別從形態(tài)學(xué)和定量上觀察糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜血

2、管內(nèi)皮細(xì)胞0cciudin和膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的改變. 結(jié)果：糖尿病2w時(shí)，視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)減少同時(shí)有Ⅵu¨er細(xì)胞GFAP表達(dá)增加。第12w時(shí)，星型膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)接近消失，而Müller細(xì)胞大量表達(dá)GFAP。Occludin在正常視網(wǎng)膜不同血管分布不同。在糖尿病時(shí)，Occludin在毛細(xì)血管表達(dá)減少，而在視網(wǎng)膜動(dòng)脈則表現(xiàn)為顆粒狀沉積. 結(jié)論：糖尿病時(shí)．視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的改變伴隨著血管內(nèi)皮

3、細(xì)胞Occludin表達(dá)的變化，說明膠質(zhì)細(xì)胞可能通過影響內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用來增加BRB的通透性，導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生。 2、新生大鼠視網(wǎng)膜MOiler細(xì)胞和新生牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：體外分離培養(yǎng)新生大鼠視網(wǎng)膜MOiler細(xì)胞和新生牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(boveinretinalvascularendothelialcells，BREC)，觀察其形態(tài)、結(jié)陶及生長情況. 方法：以酶輔助

4、顯微分離一酶消化法分離、單獨(dú)培養(yǎng)MOiler細(xì)胞和BREC．倒置相差顯微鏡觀察原代與傳代細(xì)胞生長情況，描記生長曲線．以脧質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)抗體和VonWillebrand因子抗體分別對(duì)培養(yǎng)的Muller細(xì)咆和BREC進(jìn)行免疫學(xué)鑒定．透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：體外成功培養(yǎng)出Müller細(xì)胞和BREC．GFAP抗體和VonWillebrand因子抗體染色均

5、為陽性，原代MOiler細(xì)胞呈星形、不覘則形，BREC呈多邊形、鋪路石樣，傳代細(xì)咆伸展更加明顯．呈密集單層生長。細(xì)胞生長曲線均接近“S”形。透射電鏡顯示均具有正常細(xì)胞器結(jié)陶。 結(jié)論：體外分離結(jié)合酶消化法培養(yǎng)大鼠Müller細(xì)胞及BREC．實(shí)驗(yàn)方法操作簡便，獲得的細(xì)胞純度高，符合體內(nèi)生物學(xué)特性，為體外研究兩種細(xì)胞的相互作用打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 3、糖基化終末產(chǎn)物對(duì)體外培養(yǎng)Miiller細(xì)胞生長的影響 目的：探討體外

6、Mii}ler細(xì)胞在糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)作用下增殖活性的變化 方法：采用本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)及鑒定的新生大鼠Müller細(xì)胞，設(shè)置正常生長組和添加AGEs培養(yǎng)組，AGEs濃度在250ug/ml-1000ug/ml范圍內(nèi)逐步遞增。MTT法測定AGEs對(duì)體外純化培養(yǎng)g0[[er細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果：高濃度AGEs對(duì)Miiller細(xì)胞有明顯的促增殖作用，并在一定的濃度范圍內(nèi)(250ug/mi-1000ug/mi)細(xì)胞增殖活性呈

7、劑量依賴關(guān)系。 結(jié)論：體外高濃度AGEs可促進(jìn)MUller細(xì)胞異常增殖，與臨床上觀察到增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生情況一致，因此可以在體外用高濃度AGEs模擬體內(nèi)糖尿病環(huán)境，觀察脧質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能的改變. 4、不同生長條件下Miiller細(xì)胞上清液對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響 目的：探討AGEs作用下異常增殖的Miiller細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(REC)緊密連接蛋白(Occludin)表達(dá)的影

8、響。 方法：分別收集兩組細(xì)胞的上清液，加入培養(yǎng)的BREC中，分6組觀察。第①組未添加任何細(xì)胞上清液的BREC：第②組添加正常M[iller細(xì)胞上清液后的BREC：第③組添加AGEs作用后的Miiller細(xì)胞上清液后的BREC：第④組正常培養(yǎng)條件下的MUller細(xì)胞上清液：⑤AGEs作用后的Miiller細(xì)胞上清液；⑥無細(xì)胞組．為空白對(duì)照組，EL[SA法測定6組細(xì)胞上清液中Occludin的含量，比較其變化。 結(jié)果：添加正