升麻中環(huán)菠蘿蜜烷型三萜化合物抗腫瘤活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、傳統(tǒng)中藥升麻（Cimicifuga foetidaL.）中含有大量環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類(lèi)成分，研究表明該種植物來(lái)源的環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類(lèi)化合物在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有增殖抑制作用。然而前人的研究多集中在對(duì)該類(lèi)化合物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定上，本論文旨在對(duì)從升麻中分離的此類(lèi)化合物SM306及SM308開(kāi)展抗腫瘤機(jī)制研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.化合物SM306抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的增殖活性及機(jī)制研究。MTT實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2、明M306對(duì)MCF-7細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，PI染色分析發(fā)現(xiàn)SM306能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蛋白cyclin B1和p-CDK1(Thr161)水平下調(diào)可能參與SM306誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯。Hoechst33258染色觀察及PI/AnnexinⅤ雙染分析表明SM306可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SM306作用細(xì)胞后，細(xì)胞線粒體膜電位降低、Caspase9及PARP被剪切活化，促

3、凋亡蛋白Bax水平上調(diào)而抗凋亡蛋白Bcl-2水平下調(diào)，同時(shí)磷酸化的Akt（Ser473和Thr308）被抑制，提示SM306經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步Westernblotting檢測(cè)表明，p-ERK1/2及上游主要調(diào)控蛋白p-c-Raf水平均發(fā)生下調(diào)，提示Raf/MEK/ERK信號(hào)通路參與SM306誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡。
　　2.化合物SM308誘導(dǎo)肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/ADM細(xì)胞自噬流損傷和凋亡的機(jī)制研究

4、。首先MTT實(shí)驗(yàn)表明該化合物對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞顯示出較好的增殖抑制活性，并且饑餓處理可以顯著提高其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。采用MDC染色觀察酸性囊泡，Western blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白如LC3、Beclin1，Atg5的含量變化，結(jié)果表明SM308處理后細(xì)胞出現(xiàn)了大量自噬體。進(jìn)一步采用LC3 Turnover實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞自噬流進(jìn)行評(píng)估，并且p62/SQSTM1蛋白作為自噬選擇性降解底物其水平增加，表明SM308抑制Hep

5、G2/ADM細(xì)胞自噬流。采用透射電鏡觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)大量包裹有未能降解內(nèi)容物的單層膜結(jié)構(gòu)即自噬溶酶體積累于細(xì)胞中，通過(guò)DQ-BSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SM308抑制了細(xì)胞溶酶體的降解活性。更重要的是，SM308處理細(xì)胞1h后PI3激酶P110α和p-Akt(Ser473)水平均明顯上調(diào)，說(shuō)明PI3K/Akt信號(hào)通路被活化。并且我們使用PI3K抑制劑LY294002或者Akt的siRNA處理細(xì)胞時(shí)，SM308導(dǎo)致的LC3-Ⅱ的累積量減少，

6、同時(shí)p62/SQSTM1蛋白作為自噬性降解底物其含量也發(fā)生降低，即抑制PI3K和Akt可以減輕SM308對(duì)細(xì)胞自噬流的抑制，表明PI3K/Akt通路的的活化參與SM308對(duì)細(xì)胞自噬流的抑制過(guò)程中。此外，PI/AnnexinⅤ雙染分析及Western blotting檢測(cè)等結(jié)果表明SM308可能通過(guò)內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)HepG2/ADM細(xì)胞凋亡。并且與單獨(dú)使用SM308處理細(xì)胞相比，采用饑餓處理或者用Rapamycin抑制mTOR以增強(qiáng)細(xì)