化合物6r體內(nèi)外抗腫瘤活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 依他尼酸(EA)是一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTπ）抑制劑，具有較弱的抗腫瘤活性。但由于EA生物利用度低，副作用大，限制了其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。根據(jù)生物等電子重排原理，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一系列EA噁二唑衍生物，通過篩選，發(fā)現(xiàn)化合物5-[2，3-二氯-4-(2-亞甲基-1-代丁基)氯苯]-3．甲基．1，2，4．噁二唑(6r)具有較高的抗腫瘤活性，具有進(jìn)一步研究成為抗腫瘤藥物的價(jià)值。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　

2、 體外實(shí)驗(yàn):MTT法評(píng)價(jià)化合物6r對(duì)一系列腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，并選取敏感細(xì)胞株人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞及人前列腺癌PC3細(xì)胞進(jìn)一步研究。Hoechst33258染色法，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)6r對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響;碘化丙啶(PI)單染法檢測(cè)6r對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響。Westernblotting法檢測(cè)6r對(duì)腫瘤細(xì)胞中GSTπ，EGFR，PI3K/Akt信號(hào)通路分子及周期蛋白CyclinD1表達(dá)水平的影響。

3、>　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):分別構(gòu)建裸鼠皮下接種結(jié)腸癌SW620細(xì)胞移植瘤，皮下接種前列腺癌PC3細(xì)胞移植瘤以及原位接種標(biāo)靶熒光素酶基因前列腺癌PC-3M-Luc-C6細(xì)胞移植瘤模型，以6r治療組，5．氟尿嘧啶(5-Fu)或米托蒽醌(Mitoxantrone，MA)陽(yáng)性對(duì)照組及溶劑陰性對(duì)照組進(jìn)行裸鼠實(shí)驗(yàn)。采用尾靜脈方式給藥，隔天給藥并連續(xù)給藥數(shù)周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤并稱重，通過與陰性對(duì)照組比較評(píng)價(jià)6r體內(nèi)抗腫瘤活性。Westernb

4、lotting法檢測(cè)6r對(duì)腫瘤組織中GSTπ，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，bcl-2/Bax，Cyt-C及EGFR/PI3K/Akt表達(dá)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:體外生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，6r對(duì)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)SW620及PC3腫瘤細(xì)胞半抑制率IC50分別為4.89μtM和3.79μM，選取敏感腫瘤細(xì)胞株P(guān)C3及SW620進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。Hoechst33258染色結(jié)果顯示，2μ

5、M，4μM6r可明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。熒光顯微鏡觀察，SW620及PC3細(xì)胞核染色質(zhì)濃染，固縮或聚核膜周邊，或呈塊狀碎裂改變。FITC-AnnexinV/PI雙染法試驗(yàn)結(jié)果表明，4μM6r處理SW620及PC3腫瘤細(xì)胞24h凋亡率分別為28.8％和29.41％。PI單染法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4μM6r處理SW620細(xì)胞，處于S期的細(xì)胞數(shù)比例顯著增加至66.85％;8μM6r處理PC3細(xì)胞，處于S期的細(xì)胞數(shù)比例顯著增加至22.79％，證明6r可

6、阻滯腫瘤細(xì)胞周期于S期。Westernblotting結(jié)果顯示，6r對(duì)SW620細(xì)胞及腫瘤組織中GSTπ的表達(dá)無明顯影響，8μM6r可顯著增加抑制PC3細(xì)胞中EGFR/PI3K/Akt及CyclinD1的表達(dá)水平。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組比較，以8mg/kg劑量尾靜脈注射給藥3周后，6r對(duì)結(jié)腸癌SW620皮下移植瘤生長(zhǎng)抑制率為44.17％;給藥3周后，6r對(duì)前列腺癌PC3皮下移植瘤的生長(zhǎng)抑制率為63.

7、3％;給藥4周后，對(duì)原位前列腺癌PC-3M細(xì)胞移植瘤抑制率為60.5％，且無明顯副作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明6r具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性。Westernbolotti(n)g結(jié)果顯示，6r對(duì)SW620腫瘤組織中GSTπ的表達(dá)無明顯影響。6r可顯著增加裸鼠腫瘤組織中cleaved-caspase-3的表達(dá)水平，促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，增加Bax的表達(dá)而下調(diào)bcl-2的表達(dá)，使兩者比例降低，抑制EGFR/PI3K/Akt蛋白的表達(dá)。