奧曲肽對(duì)兔肝缺血再灌注損傷的影響及機(jī)理研究.pdf

1、第一部分奧曲肽對(duì)兔肝缺血再灌注損傷血流動(dòng)力學(xué)、血液生化及炎性細(xì)胞因子的影響。 目的：觀察奧曲肽對(duì)兔肝臟缺血再灌注損傷后血流動(dòng)力學(xué)、血清酶學(xué)及炎性細(xì)胞因子的影響，以探討其對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。 方法：采用Pringle’s兔肝臟缺血再灌注模型，將24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(A組)、肝臟缺血再灌注組(B組)和奧曲肽預(yù)適應(yīng)組(C組)。觀察三組動(dòng)物肝門阻斷前(T<,1>)、阻斷后15min(T

2、<,2>)、30 min(T<,3>)、再灌注 15min(T<,4>)、30min(T<,5>)、60min(T<,6>)、120min(T<,7>)、240min(T<,8>)平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)變化； T<,1>、T<,3>、T<,5>、T<,6>、T<,7>、T<,8>各時(shí)點(diǎn)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、內(nèi)毒素(ETX)以及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β

3、(IL-1β)的變化。 結(jié)果： 1.從缺血15min至再灌注60min各時(shí)點(diǎn)B組MAP、HR明顯低于A組(P(0.01)，從缺血15min至再灌注15minC組MAP和HR明顯低于 A 組(P<0.01)，從缺血15min至再灌注60min C組又明顯高于B組(P<0.05，P<0.01)。 2.從缺血30min開始各時(shí)點(diǎn)B組、C組ALT、AST、LDH均顯著高于A組(P<0.05或p<0.01)，再灌后120m

4、in達(dá)高峰，而C組又低于B組(P<0.05或p<0.01)；從缺血30min開始B、C組血漿ETX與A組比較明顯升高(P<0.05或P<0.01)，C組明顯低于B組(P<0.01)。 3.從缺血30min開始，B組血漿TNF-α明顯高于A組(P<0.05，p<0.01)，再灌注60分達(dá)高峰，從再灌注30min開始C組血漿TNF-α明顯高于A組(P<0.05，p(0.01)，從缺血30 min開始C組血漿TNF-α明顯明顯低于B組

5、(P<0.05，p<0.01)；從缺血30min開始，B組血漿IL-1β明顯高于A組(p<0.01)，從缺血30min開始至再灌注120分C組血漿IL-1β明顯高于A組(P<0.05，p<0.01)，再灌時(shí)各時(shí)點(diǎn)C組血漿IL-1β又都明顯低于B組(P<0.05，p(0.01)。 結(jié)論： 1.奧曲肽對(duì)兔肝臟缺血再灌損傷有明顯的保護(hù)作用。 2.奧曲肽對(duì)兔肝臟缺血再灌損傷的保護(hù)作用涉及兩個(gè)方面：(1)直接的肝細(xì)胞保護(hù)；

6、 (2)下調(diào)TNF α、IL-1β等炎癥介質(zhì)和降低血漿中內(nèi)毒素水平。 第二部分奧曲肽對(duì)兔肝缺血再灌注損傷病理形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡的影響。 目的：觀察奧曲肽對(duì)兔肝臟缺血再灌注損傷后肝組織病理形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2/Bax的影響，進(jìn)一步明確其對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)理。 方法：采用Pringle’s肝臟缺血再灌注模型，將96只新西蘭大白兔隨機(jī)分為三大組：假手術(shù)組(A組)、肝臟缺血

7、再灌注組(B組)和奧曲肽預(yù)適應(yīng)組(C組)，A、B、C三大組根據(jù)不同的再灌注時(shí)間(30min、60min、120min、240min)又分為A<,Ⅰ>、A<,Ⅱ>、A<,Ⅲ>、A<,Ⅳ>，B<,Ⅰ>、B<,Ⅱ>、B<,Ⅲ>、B<,Ⅳ>和C<,Ⅰ>、C<,Ⅱ>、C<,Ⅲ>、C<,Ⅳ>亞組，光鏡觀察各亞組病理形態(tài)學(xué)變化，透射電鏡觀察A<,Ⅲ>、B<,Ⅲ>、C<,Ⅲ>組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，TUNEL 法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)A<,Ⅲ>、B<,Ⅲ>、C

8、<,Ⅲ>組肝細(xì)胞凋亡，免疫組化檢測(cè)A<,Ⅲ>、B<,Ⅲ>、C<,Ⅲ>組細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2/Bax 在肝細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果： 1.光鏡下可見采用奧曲肽預(yù)適應(yīng)的C組各亞組損傷均明顯較B組輕微，B組損傷最嚴(yán)重的是再灌注120分鐘組和240分鐘組(B<,Ⅲ>組、B<,Ⅳ>組)。 2.透射電鏡下可見C<,Ⅲ>組亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷明顯較B<,Ⅲ>組輕微。 3.TUNEL法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞凋亡C<,Ⅲ>組明

9、顯少于B<,Ⅲ>組。 4.C<,Ⅲ>組凋亡調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)Bcl-2明顯高于B<,Ⅲ>組，Bax明顯低于B<,Ⅲ>組。 結(jié)論： 1.奧曲肽能明顯減輕肝臟缺血再灌注損傷病理形態(tài)學(xué)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，抑制肝臟缺血再灌注損傷后肝細(xì)胞凋亡，上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2，下調(diào)促凋亡蛋白Bax，表明奧曲肽對(duì)肝臟缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。 2.奧曲肽對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是通過(guò)線粒體Bcl-2/Bax凋亡通路介

10、導(dǎo)的。 第三部分奧曲肽對(duì)兔肝缺血再灌注損傷蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。 目的：建立假手術(shù)組、肝缺血再灌注損傷組及奧曲肽預(yù)適應(yīng)組兔肝組織雙向凝膠電泳圖譜，并加以分析驗(yàn)證，以進(jìn)一步明確奧曲肽對(duì)肝缺血再灌注損傷保護(hù)的作用機(jī)制。 方法：采用Pringle’s 肝臟缺血再灌注模型，將24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(A組)、肝臟缺血再灌注組(B組)和奧曲肽預(yù)適應(yīng)組(C組)，三組均在缺血30min再灌注120min取肝組織；用

11、雙向凝膠電泳技術(shù)分離三組肝組織總蛋白，經(jīng)雙向凝膠電泳、考馬斯亮藍(lán)染色、ImageScanner掃描儀掃描獲得雙向凝膠電泳圖譜；PDQest圖像分析軟件分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，采用 MALDI-TOF-MS 鑒定，獲取肽質(zhì)量指紋圖譜，分析相關(guān)蛋白質(zhì)；并采用 Western blot對(duì)差異表達(dá)明顯的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1．獲得了背景清晰、重復(fù)性好的雙向凝膠電泳圖譜，經(jīng)PDQuest 2DE軟件分析，共獲得31個(gè)有明顯差異的蛋

12、白質(zhì)斑點(diǎn)，其中20個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在B組表達(dá)上調(diào)，17個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)斑在C組表達(dá)上調(diào)，7個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在B組表達(dá)下調(diào)，11個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在C組表達(dá)下調(diào)。 2．對(duì)31個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析鑒定，得到16個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)果，主要為與線粒體有關(guān)的代謝酶、分子伴侶、抗凋亡蛋白以及與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)的蛋白質(zhì)與啟動(dòng)子。 3．Western blot 方法驗(yàn)證了差異明顯的HSP70、HSP27 的表達(dá)水平。結(jié)果

13、顯示：HSP70 和 HSP27 表達(dá)水平在B、C兩組均明顯上調(diào)，且 C 組上調(diào)幅度更大，結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果一致。 結(jié)論： 奧曲肽對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制是復(fù)雜的，涉及多個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。奧曲肽主要通過(guò)調(diào)控線粒體相關(guān)的代謝酶如尼克酰胺腺嘌呤二核甘酸氧化還原酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶，增加抗損傷性物質(zhì)如HSP70、HSP27等的生成及明顯上調(diào)磷脂酰乙醇胺綁定蛋白從而抑制細(xì)胞分泌、調(diào)控細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)肝臟缺血再灌