抗氧化肽SS-31對糖尿病腎病的影響及分子機制.pdf

1、目的:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是一種最為常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是慢性腎臟疾病的主要原因。目前，有關(guān)糖尿病腎病的治療主要是干預(yù)高血糖及蛋白尿。強有效旨在保護腎功能，預(yù)防和延緩糖尿病腎病發(fā)生進展的藥物還需要進一步的研究。
　　 許多機制參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，包括遺傳因素，血流動力學(xué)因素，晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation products，AGEs)生成增多，活性

2、氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加及轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)表達上調(diào)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活等。其中，糖尿病時的高糖環(huán)境誘導(dǎo)腎臟細胞ROS生成增多，是DN造成高糖損傷的中心環(huán)節(jié)。
　　 ROS主要在線粒體產(chǎn)生。生理情況下，體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)包括谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、以及維生素C等對其進行

3、調(diào)控，使ROS的產(chǎn)生和清除趨于平衡。當(dāng)這種平衡被打破時即發(fā)生氧化應(yīng)激。過多的ROS能夠氧化細胞膜的磷脂、蛋白和核酸，通過激活一系列的下游信號通路，導(dǎo)致細胞凋亡。大量的研究已經(jīng)證實，高糖能夠誘導(dǎo)細胞ROS生成增多，過多的ROS又進一步導(dǎo)致了線粒體的損傷。這些研究提示，通過防止ROS的生成來保護線粒體可能是治療糖尿病一個有效的途徑。
　　 SS-31(D-Arg-2’，6’-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)

4、是一種能夠自由滲入細胞，靶向定位于線粒體的小分子肽。SS-31能夠清除線粒體內(nèi)過多的ROS，減少ROS的產(chǎn)生，穩(wěn)定線粒體膜電位，防止線粒體通透性的改變，減少細胞色素C的釋放，從而阻止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡。SS-31的保護作用已在許多動物模型中得到證實。有研究顯示，對于缺血性腦損傷的大鼠模型SS-31具有明顯的保護作用，它能夠有效的改善腦組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及缺血造成的損傷。對于單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral o

5、bstruction，UUO)大鼠，SS-31治療能夠明顯減輕腎臟氧化應(yīng)激損害，抑制腎小管細胞的凋亡。
　　 在本研究中我們采用單側(cè)腎切除STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，旨在觀察小分子肽SS-31對糖尿病腎病的作用及機制，明確其是否具有防止糖尿病腎病發(fā)生的潛在應(yīng)用價值。
　　 方法:
　　 1、動物模型的建立
　　 雄性CD-1小鼠隨機分為:單腎切除對照組（Control組）、單腎切除糖尿病模型組（DM組）、

6、單腎切除糖尿病SS-31干預(yù)組。糖尿病模型建立采用單一劑量STZ（150mg/kg，溶于pH4.5檸檬酸緩沖液）腹腔注射誘導(dǎo)建立小鼠Ⅰ型糖尿病模型。成模標準:給藥3天后測血糖，凡全血血糖≥16.7mmol/L，尿糖++～+++者確定為糖尿病模型。
　　 2、腎組織常規(guī)病理學(xué)觀察
　　 糖尿病小鼠模型建成給藥8周后，單腎切除對照組、單腎切除糖尿病模型DM組、單腎切除糖尿病SS-31干預(yù)組，各組取5只小鼠稱重，切取腎臟，取部

7、分腎組織置于4％多聚甲醛固定，用于光鏡(PAS)常規(guī)病理學(xué)觀察;免疫組織化學(xué)染色檢測纖連蛋白(fibronectin FN)、Ⅳ型膠原蛋白(type Ⅳ collagen，ColⅣ)、Bcl-2、Bax、TXNIP等在腎組織的表達;TUNEL染色檢測腎臟細胞的凋亡情況;取部分腎皮質(zhì)組織提取總蛋白，Western blot觀察腎皮質(zhì)Bcl-2、Bax、TXNIP、各種信號蛋白(ERK、p-ERK)、α型肌動蛋白（α-smooth musc

8、leactin，α-SMA）等的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、抗氧化肽SS-31改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠代謝紊亂。
　　 通過檢測與糖尿病腎病相關(guān)的常用指標顯示:對照組小鼠精神狀態(tài)良好，體重增加，尿量、血糖、24h尿蛋白均正常。與對照組相比，DM組小鼠體重減輕，尿量增多，血糖、24h尿蛋白明顯升高。SS-31組對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠代謝紊亂有所改善。
　　 2、SS-31減輕STZ糖尿病模型腎損害。

9、
　　 與對照組相比，DM組腎重/體重比增加;與DM組相比，SS-31干預(yù)組腎重/體重比有所減小。腎小球光鏡HE染色，PAS染色觀察:對照組腎小球腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎小球體積無明顯增大。DM組系膜區(qū)增寬，細胞外基質(zhì)增多，部分腎小球毛細血管腔擴張，部分腎組織硬化。SS-31干預(yù)能夠明顯改善上述病變。FN及ColⅣ的免疫組織化學(xué)染色:與對照相比，DM組FN和ColⅣ在腎臟表達明顯增高;與DM組比較，SS-31干預(yù)組FN和ColⅣ表達明

10、顯減少。
　　 3、SS-31對糖尿病腎臟細胞凋亡的影響
　　 TUNEL檢測結(jié)果表明，與對照組相比，DM組腎臟細胞凋亡數(shù)明顯增加;與DM組相比，SS-31干預(yù)能明顯減少糖尿病高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡。與對照組相比，DM組Bax/Bcl-2比率明顯增加;SS-31干預(yù)能明顯抑制糖尿病腎臟Bax/Bcl-2比率的增加。
　　 4、SS-31對糖尿病腎臟α-SMA表達的影響。
　　 與對照組相比，DM組α-SMA在

11、腎小管上皮細胞內(nèi)表達明顯增高;與DM組相比，SS-31干預(yù)組α-SMA表達明顯降低。
　　 5、SS-31對糖尿病腎臟TXNIP的影響。
　　 TXNIP蛋白在DM組小鼠腎小管上皮細胞表達水平明顯上調(diào);SS-31干預(yù)組能夠明顯抑制糖尿病時TXNIP蛋白的表達。
　　 6、SS-31對糖尿病腎臟ERK1/2的激活的影響。
　　 與對照組相比，DM組ERK1/2的磷酸化水平顯著增加;與DM組相比，SS-31干