激活FXR下調(diào)visfatin對糖尿病腎病的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病的重要并發(fā)癥，也是最常見的導(dǎo)致終末期腎臟疾病(End-stage renal disease，ESRD)的病因之一。其主要病理特征為腎臟結(jié)構(gòu)改變包括腎小球肥大、系膜基質(zhì)增厚、腎小球足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。這些變化共同導(dǎo)致了進行性蛋白尿增多和腎小球濾過率減少，最后發(fā)展為終末期腎病。糖尿病腎病的發(fā)病機制目前并不完全清楚，研究表明高血壓

2、、高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物、脂質(zhì)代謝異常、脂肪堆積、促纖維化生長因子、炎癥因子、氧化應(yīng)激等在糖尿病腎病進展中發(fā)揮一定的作用。
　　法尼酯X受體(Farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)屬于核受體超家族成員，是一種細(xì)胞內(nèi)信號蛋白，作為多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子激活或抑制靶基因表達(dá)。FXR在肝臟、腸、腎上腺和腎臟等組織都有高表達(dá)。現(xiàn)有研究表明FXR在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能與FXR參與調(diào)控糖脂代謝基因表達(dá)有關(guān)，但具體

3、調(diào)控機制仍不清楚。
　　visfatin是新近分離并鑒定的一種分泌型蛋白，亦稱前B細(xì)胞克隆增強因子(pre-Bcell colony ehancing factor，PBEF)，在脂肪組織、肝臟、心臟、骨骼肌、腦、腎臟等組織中均有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)visfatin在糖脂代謝、胰島素抵抗、細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)visfatin在糖尿病患者血清濃度明顯升高，參與了調(diào)控炎癥因子表達(dá)、內(nèi)皮功能損傷、胰島素

4、抵抗及動脈粥樣硬化等。體外研究亦發(fā)現(xiàn)visfatin在高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)顯著升高，外源性visfatin可促進腎小球系膜細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-1的表達(dá)上調(diào)，促進葡萄糖吸收，并刺激促纖維化基因表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)血清visfatin水平在糖尿病腎病患者明顯升高，且與炎癥因子呈正相關(guān)，與腎功能水平呈顯著負(fù)相關(guān)，提示visfatin很可能與糖尿病腎病的進程及炎癥狀態(tài)有密切相關(guān)。
　　本研究擬通過體內(nèi)體外實

5、驗闡明FXR調(diào)控visfatin表達(dá)的分子機制及其在糖尿病腎病進展過程中的作用，為深入認(rèn)識糖尿病腎病發(fā)病機制提供新的思路。
　　方法:
　　1.臨床研究部分:
　　收集2014年6月-2015年12月我科收治經(jīng)腎活檢確診的2型糖尿病腎病患者的腎活檢標(biāo)本及臨床資料，并根據(jù)病理分期分為早期DN組13例、中期DN組16例、晚期DN組18例;收集我院泌尿外科同期收治的10例腎腫瘤手術(shù)患者遠(yuǎn)離腫瘤組織的正常組織標(biāo)本為對照組;對收

6、集的腎組織標(biāo)本行PAS及visfatin免疫組化染色;患者臨床資料收集包括年齡、性別、24小時尿白蛋白、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)，并根據(jù)Cockcroft-Grault公式計算腎小球濾過率(eGFR)。并對分析統(tǒng)計結(jié)果進行如下比較:(1)比較各組24小時尿白蛋白、Scr、BUN、eGFR及visfatin表達(dá)半定量結(jié)果;(2)選取各期DN組患者24小時尿蛋白、Scr、BUN、eGFR結(jié)果，與visfatin表達(dá)半定量結(jié)果進行

7、相關(guān)性分析。
　　2.細(xì)胞實驗部分:
　　(1)采用FXR激動劑GW4064、FXR拮抗劑Guggulsterone處理人腎小球系膜細(xì)胞HMC，Real-time PCR和Western blot檢測visfatin的mRNA及蛋白表達(dá)變化;
　　(2)分別給予高糖(HG)誘導(dǎo)HMC轉(zhuǎn)染siRNA沉默visfatin、GW4064或外源性visfatin處理:①Real-time PCR檢測visfatin的mRNA表

8、達(dá)，Western blot檢測visfatin、NF-κB、IκBα的蛋白表達(dá)水平，ELISA法檢測細(xì)胞上清MCP-1濃度;②Real-time PCR檢測TGF-β1、α-SMA、CollagenⅣ及FN的的mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測TGF-β1、smad2/3、p-smad2/3、α-SMA、CollagenⅣ及FN的蛋白表達(dá)水平;③cck-8法檢測系膜細(xì)胞增殖，Real-time PCR和Western bl

9、ot檢測增殖相關(guān)基因PCNA的mRNA和蛋白表達(dá)水平;
　　3.動物實驗部分:
　　采用db/db小鼠作為糖尿病腎病動物模型，db/m小鼠作為對照，將db/db小鼠分為db/db(12w)組、db/db(16w)組、db/db(20w)組及db/db(20w)+GW4064治療組:(1)檢測各組小鼠血糖、體重、24小時尿白蛋白、Scr、BUN等生化指標(biāo);(2)取各組小鼠腎臟組織行PAS、Masson染色，進行visfatin

10、、TGF-β1、α-SMA及FN免疫組化染色;(3) Western blot檢測各組小鼠腎臟組織visfatin、NF-κB、IκBα、 TGF-β1、smad2/3、p-smad2/3、α-SMA、CollagenⅣ及FN的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.臨床研究部分:
　　(1)免疫組化染色結(jié)果顯示visfatin在DN患者腎臟組織表達(dá)，主要定位于腎小球，腎小管間質(zhì)少量表達(dá)，且visfatin表達(dá)強度隨著DN

11、的分期增加表達(dá)增強(P＜0.01，與對照組比較)。
　　(2)在早、中期DN組，visfatin表達(dá)與患者24小時尿白蛋白、Scr、BUN水平呈正相關(guān)(R=0.868，P＜0.01;R=0.913，P＜0.01; R=0.938，P＜0.01)，與患者eGFR呈負(fù)相關(guān)（R=-0.979，P＜0.01）;在晚期DN組，visfatin表達(dá)與患者24小時尿蛋白呈負(fù)相關(guān)(R=-0.499，P＜0.05)，與Scr、BUN及eGFR水平無

12、相關(guān)性(R=-0.099，P＞0.05;R=0.281, P＞0.05;R=0.026,P＞0.05)。
　　2.細(xì)胞實驗部分:
　　(1)激活FXR通過調(diào)控visfatin表達(dá)可以抑制高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖及增殖相關(guān)基因、炎癥因子、促纖維化基因的表達(dá):與對照組比，HG組細(xì)胞增殖顯著增快(P＜0.01)，GW4064組較HG組增殖速度顯著下降(P＜0.01)，GW4064組PCNA蛋白表達(dá)水平較HG組顯著下降(P＜0.01);

13、與GW4064組比，GW4064+visfatin組細(xì)胞增殖、PCNA表達(dá)顯著回升(P＜0.01);
　　(2)與對照組比，HG組p-P65蛋白表達(dá)、細(xì)胞上清MCP-1水平明顯升高(P＜0.01)，而IκBα蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.01);與HG組比，GW4064組p-P65和MCP-1表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.01)，IκBα表達(dá)明顯回升(P＜0.01);與GW4064組比，visfatin組p-P65蛋白表達(dá)、上清MCP-1

14、水平顯著上調(diào)(P＜0.01)，而IκBα表達(dá)明顯下降(P＜0.01):
　　(3)與對照組比，HG組TGF-β1、p-smad2/3、嘎-SMA、CollagenⅣ及FN的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)，GW4064組較HG組的TGF-β1、p-smad2/3、α-SMA、CollagenⅣ及FN的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01);與GW4064組比，GW4064+visfatin組TGF-β1、p-

15、smad2/3、α-SMA、CollagenⅣ及FN的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯回升(P＜0.01);
　　3.動物實驗部分:
　　(1)與db/m組比，db/db組小鼠24小時尿白蛋白、Scr、BUN顯著升高(P＜0.01)，且隨著周齡增加而逐漸升高;GW4064治療組小鼠24小時尿白蛋白、Scr、BUN較db/db組顯著下降（與16w及20w比，P＜0.01）;
　　(2) PAS及Masson染色顯示db/db小

16、鼠腎小球明顯增大，球囊擴展，糖原沉積，系膜及基質(zhì)增生，腎小球細(xì)胞外基質(zhì)增多，而GW4064治療組腎小球的上述改變明顯減輕;免疫組化染色顯示，visfatin主要表達(dá)于腎小球，腎小管間質(zhì)有少量表達(dá)，db/db組小鼠visfatin表達(dá)隨著小鼠周齡增加逐漸增強，GW4064治療組表達(dá)明顯下降，TGF-β1、旺-SMA和FN的免疫組化染色結(jié)果顯示其趨勢同visfatin免疫組化染色;
　　(3)Western blot結(jié)果顯示，與db/

17、m組比，db/db組visfatin蛋白表達(dá)顯著升高，且隨著周齡增加而逐漸升高(P＜0.01)，p-P65、TGF-β1、p-Smad2/3、α-SMA、CollagenⅣ和FN表達(dá)趨勢同visfatin表達(dá)(P＜0.01，與db/m組比);GW4064組visfatin蛋白表達(dá)較db/db組顯著下降（與16w及20w比，P＜0.01）;p-P65、TGF-β1、p-Smad2/3、α-SMA、CollagenⅣ和FN的表達(dá)也明顯下調(diào)（