海參腦苷脂的分離純化、結構分析及其生物活性研究.pdf

1、海參是一種名貴的海洋滋補品,富含多種生物活性成分,具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。海參腦苷脂及長鏈堿是存在于海參體壁中結構獨特的鞘脂類化合物,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護、抗菌等生理活性。海參腦苷脂包括三種主要系列物,每種系列物中含有幾十種單體化合物。本論文對仿刺參、海地瓜和葉瓜參三種海參的腦苷脂及長鏈堿的分離純化、分子組成和結構以及生理活性進行了較為系統(tǒng)的研究,對于海洋新原料來源的發(fā)現(xiàn)、海參新型營養(yǎng)功效的補充、海參的高值化開發(fā)利用具有

2、重要意義。本文研究內(nèi)容和結果如下:
　　 1.建立海參中腦苷脂含量簡便準確測定的新方法。采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD),以TSK gel CN-80Ts柱為分離柱,正己烷-異丙醇-二氯甲烷-甲醇為流動相,在13min內(nèi)實現(xiàn)了腦苷脂和神經(jīng)酰胺的同時測定。其中,腦苷脂的檢出限為0.01μg,加標平均回收率為94.28％,RSD為5.67％,方法穩(wěn)定性良好。在所測13種水產(chǎn)樣品中,海星的腦苷脂和神經(jīng)酰胺含量最

3、高,在所測8種海參中葉瓜參腦苷脂含量最高。結果表明該方法可行,樣品前處理簡單,快速準確。結果提示包括海參在內(nèi)的海洋食品可以作為功能性鞘脂類的良好資源。
　　 2.建立一套用于各種海參腦苷脂分離純化的快速高效的完整新體系。首次應用高速逆流色譜(HSCCC)技術成功優(yōu)化了海參腦苷脂的分離過程。(1)海參總腦苷脂:采用石油醚-甲醇-水(5:4:1,V/V)為溶劑體系的高速逆流色譜法,從海參總脂中一步純化制備出海參總腦苷脂,以總脂計得率

4、約為7.6～12.4％,經(jīng)正相HPLC-ELSD法檢測其純度達90％以上。(2)海參腦苷脂系列物:先經(jīng)一次正相硅膠柱層析,收集氯仿:甲醇(80:20,V/V)洗脫組分,再采用乙酸乙酯-乙醇-水(5:3.5:3.5,V/V)為溶劑體系的高速逆流色譜技術,將上述洗脫組分中嚴重干擾海參腦苷脂純化的硫酸酯化甾醇去除,制得海參腦苷脂系列物的總得率約為1.1～6.4％,純度均在90％以上。并以優(yōu)化出的正相HPLC制備法進行了驗證比較。(3)海參腦苷

5、脂單體化合物:采用反相HPLC法,C18半制備柱,98％甲醇水溶液洗脫,從海地瓜腦苷脂系列物中分離出4個腦苷脂單體化合物,純度在90％以上。結果表明,所建立的腦苷脂純化體系具有得率高、速度快、成本低等突出優(yōu)點,從根本上解決了海參腦苷脂純化的難題。
　　 3.建立海參腦苷脂分子種組成和結構篩選的高通量分析方法。
　　 先采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法,分析比較了三種海參腦苷脂系列物的脂肪酸、長鏈堿和糖基組成差異。用1

6、0％鹽酸/甲醇水解,正己烷萃取脂肪酸甲脂組分,甲醇保留長鏈堿和糖基組分。脂肪酸甲酯直接用INNOWax柱分析,長鏈堿和甲基糖經(jīng)硅烷化衍生后用HP-5MS柱分析。測定結果:所有腦苷脂系列物的糖基都為葡萄糖基;腦苷脂系列物Ⅰ的脂肪酸以非羥基脂肪酸為主,系列物Ⅱ和Ⅲ的脂肪酸以羥基脂肪酸為主;系列物Ⅰ和Ⅱ中,少見的d17:1長鏈堿比例較高,系列物Ⅲ中以t17:0長鏈堿為主,三種海參相比,仿刺參與葉瓜參的長鏈堿組成相似,主要為d18:2和d17:

7、1,而海地瓜長鏈堿組成較簡單,主要為d17:1和t17:0。并推測出9種海參腦苷脂系列物的結構通式。
　　 又采用高效液相色譜.電噴霧離子阱-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI-IT-TOF)技術,篩選分析三種海參總腦苷脂的腦苷脂分子種組成。采用TSKgel ODS-100Z柱分離,95％甲醇/水溶液洗脫,正ESI電離模式,根據(jù)一級質(zhì)譜中同時出現(xiàn)的[M+H]+、[M+Na]+和[M+H-18]+峰確定母離子,通過自動MS/MS采集m

8、/z200～300子離子數(shù)據(jù),并分析它們的結構。分別從海地瓜、葉瓜參和仿刺參總腦苷脂中高通量篩選出12、41、26個腦苷脂化合物,其中包含疑似新化合物28個。
　　 最后,應用高效液相色譜-電噴霧四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI-Q-TOF)技術,成功建立了高通量、準確篩選分析腦苷脂分子種組成及結構的新方法。采用Plus C18柱,95％7,腈/水洗脫,負ESI電離模式,自動MS/MS采集數(shù)據(jù),一級質(zhì)譜掃描范圍m/z500

9、～1000,利用軟件自動提取含m/z179子離子的所有化合物,再根據(jù)二級子離子掃描篩出其中中性丟失為162的化合物。利用此方法,從海地瓜的三種腦苷脂系列物中分別篩選出28、20、12個腦苷脂化合物,其中31個為疑似新化合物。實驗結果表明,與GC-MS和LC-ESI-IT-TOF法相比,此法測定靈敏度更高,結構信息全面,推測結果更準確。該方法的建立,為腦苷脂單體化合物的研究提供了捷徑,為構效關系的深入研究提供了結構信息。
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10、.建立海參長鏈堿的高效制備新方法。海參總脂經(jīng)皂化酸解后,采用溶劑體系為正己烷-甲醇-水(1:2:1,V/V)的高速逆流色譜法分離,以正ESI-MS法確證了長鏈堿目標洗脫組分,分離制備出三種海參長鏈堿,得率約為6.3％～10.9％,純度均達到92％以上。采用LC-MS法分析了海參長鏈堿的組成和結構。該法具有制備量大、純化周期短、得率高等突出優(yōu)點。說明高速逆流色譜技術在長鏈堿類的快速純化制備研究中具有很強的應用潛力。
　　 5.研究

11、海參腦苷脂及長鏈堿的抗腫瘤和抗炎活性,初步探討其構效關系。(1)抗腫瘤作用:主要采用MTT法,分別考察了不同濃度、不同作用時間下海參腦苷脂及長鏈堿對Caco-2,S180和HL-7702三種細胞系的增殖抑制作用情況。結果表明,海參總腦苷脂對Caco-2癌細胞增殖均有極顯著的抑制作用;不同腦苷脂系列物對Caco-2細胞的抑制率存在顯著差異,且活性效果優(yōu)于GalCer,海參長鏈堿的抗腫瘤細胞增殖活性遠強于腦苷脂本身;提示腦苷脂抗腫瘤活性與化

12、學結構之間存在構效關系。(2)抗炎作用:采用Caco-2分化成的小腸上皮細胞,通過添加TNF-α和不同濃度的葉瓜參腦苷脂,熒光定量PCR法檢測Caco-2細胞炎癥因子IL-8 mRNA的表達量,表明葉瓜參腦苷脂具有較強的抗炎作用。以上結果提示,海參腦苷脂尤其是長鏈堿是重要生物活性成分,在新型海洋功能食品或海洋藥物開發(fā)領域具有一定的應用前景。
　　 通過以上研究,本文應用高速逆流色譜技術,解決了海參腦苷脂及長鏈堿分離純化中存在的難