戊型肝炎病毒衣殼蛋白主要功能性區(qū)段抗體譜分析.pdf

1、戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是引起急性病毒性肝炎的主要病原體之一，經(jīng)糞口途徑傳播。因水源污染引發(fā)的大規(guī)模暴發(fā)流行多見于發(fā)展中國家，在全世界范圍內(nèi)均常見戊肝的散發(fā)流行及食源性小暴發(fā)。戊肝的病死率為0.2-4％，高于甲肝，孕婦病死率可高達(dá)20％。在全球范圍內(nèi)，戊型肝炎已成為一項(xiàng)重大的公共衛(wèi)生問題。
　　HEV基因組包含3個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），其中ORF2編碼的衣殼蛋

2、白(pORF2)廣泛參與了HEV宿主識別、感染、致病等多個(gè)過程。自2009年以來，研究者們成功解構(gòu)了多個(gè)HEV不同基因型的衣殼蛋白晶體結(jié)構(gòu)，從而展示出病毒的外表面結(jié)構(gòu)。對HEV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究表明，由HEVORF2的a.a.459-606所編碼的同源二聚體結(jié)構(gòu)域E2s(E2s domain)是有效刺激機(jī)體保護(hù)性抗體應(yīng)答的最小單元，同時(shí)也是參與HEV早期感染過程的主要區(qū)域。因此對該區(qū)段的結(jié)構(gòu)與功能的深入研究對于探索HEV與宿主間相

3、互作用的分子機(jī)制具有重要意義。
　　本研究以能識別HEV E2s domain的抗體作為工具建立了HEV E2s domain表位研究的方法。通過對抗體盤的性質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為統(tǒng)計(jì)參數(shù)并引入統(tǒng)計(jì)聚類分析方法，本研究成功將該domain表面的主要抗體識別表位分為6個(gè)區(qū)域，并建立了對應(yīng)的代表性單抗盤（包含了分別識別這6個(gè)表位區(qū)的代表性抗體群）。通過建立起基于病毒-細(xì)胞吸附的體外中和評價(jià)模型，本研究進(jìn)一步對代表性抗體的中和活性進(jìn)行了評價(jià)，

4、并鑒定了4個(gè)中和抗體群。同時(shí)抗體-血清阻斷結(jié)果顯示出，這4個(gè)中和抗體群均能阻斷血清的反應(yīng)性（血清來源于感染HEV的恒河猴以及接種HEV疫苗的人）。這表明在病毒感染或疫苗接種后這些抗體針對的表位在感染或免疫進(jìn)程中更為優(yōu)勢地被呈遞，并有效激發(fā)了機(jī)體的保護(hù)性抗體應(yīng)答。
　　本研究進(jìn)一步利用丙氨酸掃描技術(shù)對HEV衣殼蛋白表面的抗體敏感氨基酸殘基進(jìn)行了鑒定，從而定位出E2s domain6個(gè)主要表位區(qū)的。結(jié)合上述的發(fā)現(xiàn)，結(jié)果顯示E2s do

5、main上二聚體交界面的頂端以及單體側(cè)的“grooze”區(qū)為刺激保護(hù)性抗體應(yīng)答的兩個(gè)主要區(qū)域。
　　此外，本論文還在anti-HEV人抗篩選上做了初步探索，成功建立了基于多色流式分選的特異anti-HEV記憶B細(xì)胞的篩選平臺，旨在通過所分選的特異記憶B細(xì)胞篩選到HEV的功能性抗體，為疫苗接種后人體內(nèi)的抗體應(yīng)答進(jìn)程的研究做準(zhǔn)備。
　　綜上所述，本研究通過建立新的構(gòu)象抗體分類方法，發(fā)現(xiàn)了HEV衣殼蛋白表面主要功能性結(jié)構(gòu)域E2s