HGF-MCP-I雙基因序貫轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)動(dòng)脈側(cè)支生成降低肺動(dòng)脈高壓的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建HGF和MCP-1雙基因生血管系統(tǒng)并應(yīng)用于肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型,從在體水平上,探討序貫應(yīng)用生血管基因肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1),通過(guò)程序性促進(jìn)血管新生和功能性側(cè)支動(dòng)脈的成熟,而降低肺動(dòng)脈高壓可行性。
　　 方法:利用pBHG lox△E1,3 Cre輔助包裝系統(tǒng),構(gòu)建EGFP-MCP-1真核表達(dá)質(zhì)粒,以293T細(xì)胞為工具細(xì)胞,包裝腺病毒:Ad-HGF和Ad-EGFP-MCP-1,純化并檢

2、測(cè)病毒滴度。使用正常成年SD大鼠,腹腔一次性注射1％野百合堿溶液(50mg/kg),構(gòu)建藥物誘導(dǎo)性肺動(dòng)脈高壓模型。對(duì)照組腹腔注射同體積乙醇生理鹽水(乙醇:生理鹽水為2:8)。4周后行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)核病理形態(tài)學(xué)觀察,檢測(cè)模型是否構(gòu)建成功。
　　 在體病毒轉(zhuǎn)染途徑采用經(jīng)皮氣管穿刺滴入法,病毒劑量(2×109pfu)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組:(A)HGF/MCP-1雙基因同期轉(zhuǎn)染組(n=12):經(jīng)氣管同時(shí)滴入Ad-HGF和Ad-EGFP

3、-MCP-1;(B)HGF/MCP-1雙基因序貫轉(zhuǎn)染組(n=12):經(jīng)氣管滴入Ad-HGF,2周后經(jīng)氣管滴入Ad-EGFP-MCP-1;(C)HGF單基因轉(zhuǎn)染組(n=12):經(jīng)氣管滴入Ad-HGF;(D)MCP-1單基因轉(zhuǎn)染組(n=12):經(jīng)氣管滴入Ad-EGFP-MCP-1;(E)對(duì)照組(n=12):經(jīng)氣管滴入同體積PBS緩沖液。各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物飼養(yǎng)2周后,隨機(jī)抽取3只/組,取各組動(dòng)物肺組織,RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染目的基因的mRNA表達(dá)、免

4、疫組化染色檢測(cè)目的基因的蛋白表達(dá)情況。其余動(dòng)物飼養(yǎng)4周后,正中開胸,肺動(dòng)脈插管以Maclab/8s多功能生理儀檢測(cè)行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè);然后取各組動(dòng)物肺組織,采用免疫熒光雙標(biāo)(抗-FⅧ標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞、α-SMA標(biāo)記血管中層平滑肌細(xì)胞)染色和lectin灌注+α-SMA標(biāo)記檢測(cè)肺微血管(小靜脈,小動(dòng)脈)密度和成熟度。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建并包裝Ad-EGFP-MCP-1。經(jīng)呼吸道途徑轉(zhuǎn)染藥物誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型,

5、熒光顯微鏡下觀測(cè),3天后目的基因可在肺組織中穩(wěn)定表達(dá),1-2周達(dá)高峰,持續(xù)約4周。
　　 2、成功建立藥物誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓模型。腹腔注射1％野百合堿溶液4周后,模型動(dòng)物肺動(dòng)脈測(cè)壓(PASP41.41±0.56mmHg;PADP24.36±0.68mmHg,mPAP29.86±0.05mmHg),與對(duì)照組(PASP23.25±0.131mmHg;PADP8.55±0.42mmHg;mPAP19.04±0.05mmHg)比較,明顯

6、升高,實(shí)驗(yàn)組肺組織病理學(xué)檢查顯示肺小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄,肺小動(dòng)脈管壁厚度指數(shù)(TI0.72±0.03)和面積指數(shù)(AI0.91±0.20)明顯高于對(duì)照組(TI0.31±0.02;AI0.41±0.02)。
　　 3、病毒感染2周后檢測(cè)所取肺組織,RT-PCR、免疫組化結(jié)果顯示:在單基因和雙基因轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染HGF和MCP-1基因在mRNA和蛋白水平均能較好的表達(dá);而對(duì)照組未見表達(dá)。
　　 4、血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化、內(nèi)皮

7、細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞熒光雙標(biāo)染色顯示:HGF/MCP-1雙基因序貫轉(zhuǎn)染組微血管數(shù)量(17.33±0.15)較對(duì)照組(9.03±0.71)明顯升高,但低于HGF單基因轉(zhuǎn)染組(19.23±0.25);血管平滑肌細(xì)胞數(shù)量(5.55±0.07)較對(duì)照組(2.23±0.15)明顯升高,但低于MCP-1單基因轉(zhuǎn)染組(7.57±0.07);但序貫轉(zhuǎn)染組較其他各組內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞貼合更緊密、血管結(jié)構(gòu)更完整。Lectin功能性血管灌注染色顯示:HGF/M

8、CP-1雙基因序貫轉(zhuǎn)染較其他各組能得到更有效的血管灌注,生成的功能性新生動(dòng)脈血管數(shù)量更多。
　　 5、肺動(dòng)脈壓測(cè)定顯示:HGF/MCP-1雙基因序貫轉(zhuǎn)染組肺動(dòng)脈平均壓(17.96±1.04mmHg)明顯低于對(duì)照組(30.06±1.44mmHg)和其它各組;HGF單基因轉(zhuǎn)染組可見肺動(dòng)脈平均壓較對(duì)照組有所降低;而MCP-1單基因轉(zhuǎn)染組、HGF/MCP-1同期轉(zhuǎn)染組肺動(dòng)脈平均壓與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論: