抑郁癥血漿microRNA表達譜及潛在診斷標志物的研究.pdf

1、背景：
　　抑郁癥是最常見的精神疾病之一，其發(fā)病率和復發(fā)率高，而就診率和治愈率低，這給個人、家庭和社會帶來了沉重的負擔。目前抑郁癥的診治仍存在諸多挑戰(zhàn)，主要有：（1）發(fā)病機制研究尚停留在各種假說層面，如單胺類神經遞質假說、細胞因子假說、下丘腦-垂體-腎上腺軸假說、表觀遺傳調控假說以及神經發(fā)生障礙和突觸可塑性異常假說等。（2）缺乏客觀有效的輔助診斷指標/方法。（3）抗抑郁藥物起效慢，對部分患者療效差。因此，目前迫切需要繼續(xù)探索抑郁癥

2、的病理生理機制，發(fā)現(xiàn)早期診斷的生物標志物以及新的治療靶點。
　　microRNA（miRNA）是長約19~23nt的RNA分子，在基因表達過程中進行轉錄后調控，在腫瘤等臨床疾病的病理生理機制探索及潛在疾病診斷生物標志物篩選等領域中有廣泛的研究前景。文獻報道，中樞神經系統(tǒng)中存在腦組織特異性或富集表達的miRNA，急性或慢性應激會導致一些miRNA表達失調。故我們推測，miRNA在抑郁癥的病理生理過程中扮演重要角色，并可能通過表達譜及

3、靶向分析尋找到潛在的抑郁癥診斷標志物。
　　目的：
　　分別基于鎖核酸雜交芯片技術和實時定量PCR技術對抑郁癥患者血漿差異miRNA進行表達譜分析及靶向研究，初步探討差異miRNA在抑郁癥病理生理機制中的潛在作用及其臨床意義，為篩選抑郁癥診斷標志物提供研究基礎。
　　方法：
　　1.提供臨床樣本志愿者招募：本研究在重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院精神科門診收集重性抑郁障礙及雙向情感障礙患者；在重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院體檢

4、中心收集正常對照者；在重慶市精神病院住院部收集精神分裂癥患者。精神疾病患者分別由兩名精神科專家依據《精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊》（DSM-IV）對患者進行診斷。對上述三種精神疾病患者分別進行漢密爾頓抑郁量表、貝克抑郁自評量表、Beck-Rafaelsen躁狂量表及陽性與陰性癥狀量表進行疾病嚴重程度評分。所有試驗對象入組時均進行血常規(guī)及血生化（肝腎功能）檢查。嚴格按照實驗設計擬定的納入和排除標準入組實驗對象。所有納入研究的志愿者均簽署了書面知

5、情同意書。第一部分納入30例實驗對象（抑郁癥16例，正常對照14例）。第二部分第一階段納入70例實驗對象（抑郁癥和正常對照各35例），第二階段納入300例實驗對象（抑郁癥100例，雙向情感障礙和精神分裂癥各50例，正常對照100例）。
　　2.抑郁動物模型的建立：采用慢性不可預見性溫和刺激對大鼠進行抑郁模型建造，運用體重、糖水消耗實驗及曠野實驗判定抑郁大鼠模型建立成功與否。
　　3.實驗標本的采集與保存：臨床血液用EDTA抗

6、凝的真空采血管經靜脈穿刺采集，大鼠血液經水合氯醛深麻醉大鼠后通過心尖穿刺獲取，并于采集后1小時內進行分離血漿處理，血漿分裝后-80°C保存?zhèn)溆?。大鼠心臟采血結束后斷頭處死，解剖分離腦組織，取前額葉、海馬及嗅球組織后放入1.5ml去RNA酶EP管中，液氮速凍，最后所有標本-80°C保存?zhèn)溆谩?br>　　4.采用TrizolRNA提取法提取血漿及腦組織RNA。抽提后的RNA采用紫外吸收法測定RNA濃度與純度，采用變性瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA

7、的完整性和基因組DNA污染。
　　5.基于鎖核酸miRNA雜交芯片技術，分析抑郁癥和正常對照血漿的miRNA表達譜，設定倍數(shù)差異>1.3，P值<0.05為閾值判斷抑郁癥患者血漿的差異表達miRNA，建立抑郁癥血漿miRNA表達數(shù)據庫。
　　6.通過對差異miRNA的靶基因分析、GeneOntology及Pathway分析等生物信息學手段，初步探索差異miRNA在抑郁癥病理生理機制中的潛在作用。
　　7.運用實時定量PC

8、R方法，檢測血漿、腦組織miR-134的表達，觀察該指標在抑郁癥是否存在改變，并判斷其在抑郁癥中的診斷價值。
　　結果：
　　1.通過芯片表達譜分析（抑郁癥16例，正常對照14例），發(fā)現(xiàn)75個差異表達miRNA，其中含未命名的miRNA序列6個；含病毒編碼的miRNA序列8個，其中顯著上調的病毒編碼miRNA有ebv-miR-BART6-3p和hsv2-miR-H4-3p，上調倍數(shù)分別為1.45倍及1.795倍；hsa-mi

9、R-124-3p、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-147b、hsa-miR-196a-3p、hsa-miR-1255a、hsa-miR-604、hsa-miR-511、hsa-let-7a-5p八個差異miRNA在抑郁組和對照組中的區(qū)分度最為明顯。進一步對所有差異miRNA進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其參與MAPK及Wnt信號通路的調控，另外還參與神經營養(yǎng)因子的信號途徑，以及中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、神經發(fā)生和突觸可塑性調控等。

10、　　2.通過實時定量PCR分析，在35例抑郁癥及35例正常對照血漿中初步發(fā)現(xiàn)抑郁組血漿miR-134水平明顯低于對照組，經常用抗抑郁治療后隨癥狀好轉血漿miR-134水平亦回復，但仍明顯低于對照組。抑郁癥患者中，更低的血漿miR-134水平提示較差的預后。進一步擴大樣本到100例抑郁癥、100例正常對照、50例雙向情感障礙、50例精神分裂癥后發(fā)現(xiàn)，抑郁組、雙向情感障礙組及精神分裂組血漿miR-134水平均顯著低于對照組，但抑郁組較雙向情

11、感障礙及精神分裂組的血漿miR-134水平更低，具有顯著的統(tǒng)計學差異。血漿miR-134在抑郁癥及正常對照人群中診斷抑郁癥的靈敏度為79％，特異性84%，在抑郁癥、雙向情感障礙、精神分裂癥及正常對照人群中診斷抑郁癥的靈敏度為79%，特異性76.5%。與臨床樣本研究的結果一致，動物實驗亦證實慢性應激導致大鼠血漿及海馬、前額葉皮質的miR-134水平明顯下調。
　　結論：
　　1.八個差異miRNA在抑郁組和對照組中的區(qū)分度最為