糖皮質激素調控肝臟膽汁酸代謝的研究.pdf

1、目的:糖皮質激素由于其強大的抗炎作用而被廣泛使用，然而包括胰島素抵抗、骨質疏松、肌肉萎縮等副作用的存在限制了其長期使用。此外，糖皮質激素最近被認為是肝臟膽汁酸淤積和膽囊疾病的重要影響因素，但其分子機制仍然未明。已知膽汁酸代謝平衡受核受體法尼醇X受體(FXR)和SHP的調控。在本系列實驗中我們將重點探討糖皮質激素所導致的膽汁酸代謝紊亂和FXR信號通路的相互關系，及其作用機制。
　　方法:
　　1.我們檢測了Cushing綜合征

2、和肥胖患者血清中糖皮質激素和膽汁酸水平，對比其與正常人的差異并分析其相關性;
　　2.為確定糖皮質激素對膽汁酸平衡的影響，我們對C57BL/6小鼠給予劑量為1mg/kg的地塞米松處理后研究膽囊、肝臟、血液膽汁酸的含量;
　　3.為解決DEX導致的膽汁酸生成的分子基礎，我們對參與膽汁酸和膽固醇代謝的基因進行了系統(tǒng)性的定量分析。并檢測了FXR、SHP等調控因子的水平。為進一步確定糖皮質激素在糖皮質激素在調控SHP表達中的作用，我

3、們研究了血清糖皮質激素和肝臟SHP表達的節(jié)律變化;
　　4.為進一步探討GR在膽汁酸平衡中的作用，我們對db/db小鼠中采用了GR的一種拮抗劑RU486，下一步，我們通過尾靜脈給db/db小鼠注射了GR shRNA腺病毒，然后分別檢測了肝臟內和系統(tǒng)循環(huán)中膽汁酸的積聚水平以及SHP表達、Cyp7A1與Cyp8b1表達;
　　5.在HEK293T細胞糖皮質激素和GW4064處理后行熒光素酶報告基因實驗，檢測SHP啟動子激活。構建

4、并轉染GR配體結合結構域丟失或者突變、GR DNA結合結構域突變的質粒后，檢測糖皮質激素是否仍然可以抑制SHP的轉錄活性。DEX處理后，檢測GR是否轉位入核與FXR在細胞核內的結合。行GST下拉實驗檢測GR和FXR之間存在直接的物理性結合。行CHIP試驗檢測HepG2細胞經DEX處理后其SHP啟動子FXRE區(qū)招募的GR是否增加;
　　6.我們用DEX和對照溶劑分別處理了FXR野生型和敲除小鼠。檢測DEX處理是否增加小鼠肝臟和血清膽

5、汁酸水平，引起肝臟SHP降低和Cyp7A1、Cyp8B1增加。在分離的原代肝細胞中我們做了相同的實驗。此外，我們觀察了FXR野生型和敲除的肝臟細胞經DEX處理后GR是否被招募到SHP啟動子區(qū);
　　7.我們做了一個CHIP實驗來尋找在HepG2細胞中GR轉錄抑制活性所需要的共抑制因子，檢測了CtBP或者SMRT在DEX干預后是否被招募到SHP的啟動子區(qū)，使用siRNA沉默CtBP后是否可以解除DEX對SHP的抑制作用，免疫共沉淀試

6、驗檢測CtBP是否可以與GR結合。采用了CtBP腺病毒shRNA通過尾靜脈注射進小鼠體內后又開始給予了7天的DEX干預處理。在注射Ad-shRNA的小鼠檢測肝臟膽汁酸濃度能否被糖皮質激素所增加，以及肝臟SHP、Cyp7A1和Cyp8B1的相應變化;
　　8.我們檢測了使用合成激動劑GW4064激活FXR后是否可以保護DEX導致的膽汁酸過量生成和淤積。首先檢測了是否激活FXR，存在SHP增加和Cyp7A1、Cyp8B1表達的減少，肝

7、臟和血清膽汁酸水平、血清ALT、膽紅素水平在GW4064干預組能否下降。
　　結果:
　　1.Cushing綜合征和肥胖患者血清糖皮質激素水平升高，同時這些患者的血清膽汁酸水平比正常人群對照相升高。血清糖皮質激素水平與血清膽汁酸水平在肥胖與非肥胖人群都存在相關性;
　　2.對C57BL/6小鼠給予地塞米松處理14天后，肝重和膽囊體積均增加，血清和肝內膽汁酸顯著上升，而血清和肝臟膽固醇水平并沒有改變。膽囊內膽汁酸和膽固醇

8、水平在DEX處理組小鼠也增加，而磷脂濃度卻降低。血清ALT水平在DEX處理組增加，這提示了肝細胞損傷的存在;
　　3.DEX顯著增加Cyp7a1和Cyp8b1的表達，而后兩者參與了膽汁酸合成的經典通路。FXR靶基因BSEP表達增加，它在膽汁酸向外運輸中起重要作用，Mdr2的降低則和DEX處理組小鼠膽囊中磷脂降低有關，負責將膽汁酸向體循環(huán)轉運的Mrp3和Mrp4也急劇增加。我們發(fā)現(xiàn)SHP顯著減少，而FXR卻沒有改變。C57BL/6小

9、鼠表現(xiàn)出很明顯的皮質酮水平晝夜節(jié)律，而SHP表達則是呈現(xiàn)一個相反的節(jié)律，此外，SHP mRNA的表達節(jié)律在給小鼠尾經靜脈注射帶有GR shRNA的腺病毒后被阻斷;
　　4.肝臟和血清中膽汁酸濃度在RU486處理后明顯減少，相對應地SHP表達上升，而Cyp7A1和Cyp8b1則下降。肝臟的GR表達量與對照組非特異性shRNA處理小鼠相比下降了70％，在GR缺陷的小鼠肝臟和系統(tǒng)循環(huán)內膽汁酸濃度顯著下降，相一致的是，SHP表達上升，而C

10、yp7A1和Cyp8b1則下降，肝臟GR缺陷也降低了血清ALT水平;
　　5.DEX處理的HepG2細胞SHP表達下降，我們發(fā)現(xiàn)糖皮質激素在GW4064存在的情況下也可以有效抑制SHP的表達。熒光素酶報告基因實驗也顯示了在HEK293T細胞中DEX可以在GW4064存在或不存在的情況下抑制SHP啟動子激活。GR LBD的丟失或者突變會導致糖皮質激素對SHP的轉錄抑制作用消失，而GR DBD突變之后，糖皮質激素仍然可以抑制SHP的轉

11、錄活性。IP實驗發(fā)現(xiàn)DEX處理后，GR轉位入核，這提高了GR和FXR在細胞核內的結合。GST下拉實驗后來揭示了GR和FXR之間存在直接的物理性結合。而且，剔除FXR的AF2后阻斷了其與GR的結合。CHIP試驗也顯示了HepG2細胞經DEX處理后其SHP啟動子FXRE區(qū)招募的GR增加;
　　6.DEX處理只增加FXR WT小鼠肝臟和血清膽汁酸水平，而在KO小鼠則無效。相應地，DEX引起的肝臟SHP降低和Cyp7A1、Cyp8B1增加

12、也只是在FXR WT小鼠中可觀察到，而KO小鼠則無。在原代肝細胞中也是如此。此外，我們觀察到FXR野生型的肝臟細胞經DEX處理后GR被招募到SHP啟動子區(qū)，而FXR敲除的細胞則沒有招募;
　　7.我們發(fā)現(xiàn)CtBP而不是SMRT在DEX干預后被招募到SHP的啟動子區(qū)。使用相應siRNA沉默CtBP后可以解除DEX對SHP的抑制作用。CtBP在免疫共沉淀試驗中可以GR結合。肝臟CtBPmRNA和蛋白表達在使用腺病毒-shRNA后都急劇

13、減少，注射Ad-shRNA的小鼠肝臟膽汁酸濃度不能被DEX所增加。肝臟SHP、Cyp7A1和Cyp8B1的相應變化也可以在注射CtBP Ad-shRNA的小鼠中觀察到;
　　8.FXR合成激動劑GW4064激活FXR后可以保護糖皮質激素導致的膽汁酸過量生成和淤積。這種干預可以激活FXR，表現(xiàn)為SHP的增加和Cyp7A1、Cyp8B1表達的減少。此外，肝臟和血清膽汁酸水平、血清ALT在GW4064干預組也明顯下降。
　　結論: