牛腦紋狀體多巴胺D-,2-受體的純化和帕金森病患者腦脊液中D-,2-受體抗體的檢測(cè).pdf

1、上海醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文牛腦紋狀體多巴胺D受體的純化和帕金森病患者腦脊液中D受體抗體的檢測(cè)姓名：郭舜源申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：蔣雨平20000501上海醫(yī)科j洋碰士研究生畢■啦文從屠宰場(chǎng)取得宰殺1～2h內(nèi)的新鮮牛腦，分離紋狀體，凍存在一80℃?zhèn)溆?。紋狀體經(jīng)勻漿，差速離心，最后得到的沉淀為P，P；制劑(線粒體微粒體制劑)。以膽酸和氯化鈉增溶P2P，制劑，超速離心后得上清液為增溶制劑。利用親和層析法，增溶制劑中的D，受體吸

2、附在氟哌啶醇偶聯(lián)的環(huán)氧活化Sepharose6B上，用含500nM螺哌隆和O1mg／ml牛腦總脂提取物的平衡緩沖液洗脫，分管(3ml／管)或合并收集洗脫液，充分透析。采用放射性配基結(jié)合分析([3H]螺哌隆結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn))測(cè)定D：受體的平衡解離常數(shù)(K)和配基結(jié)合特性，用SDSPAGE和銀染鑒定受體純度及分子量。結(jié)果：1親和層析：從上樣液(增溶制劑)與穿過液的[3II]螺哌隆結(jié)合量差異中發(fā)現(xiàn)，上樣液中的D，受體約70％被吸附在柱上

3、。經(jīng)過一次親和層析，D，受體被純化約1900倍，回收率約87％，比活性為1687pmol／mg。2結(jié)合特異性(1)結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn)：通過Scatchard作圖分析受體的平衡解離常數(shù)(Kd)，發(fā)現(xiàn)純化受體的Kd值為O2711M，膜制劑D：受體的Kd值為O92nM，增溶制劑D，受體的Kd值為058nM。(2)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：4種多巴胺受體拮抗劑與多巴胺受體親和力大?。郝葸呗∮倚妓嗯肆⑼哙ご?。3D，受體的純度分析：經(jīng)0I％SDS10％P

4、AGE和銀染分析后，膜制劑和增溶制劑中的蛋白譜帶很多，而純化的受體蛋白譜帶分子量約94kD。第二部分：帕金森病患者腦眷液中抗D：受體抗體的檢測(cè)采用免疫組化和免疫生化技術(shù)檢測(cè)PD患者腦脊液中是否存在抗多巴胺D，受體抗體。30例PD患者腦脊液(CSF)，15例正常人CSF(10例與PD患者年齡匹配，5例為年輕人)及7例PD患者血清。腰穿取得CSF，經(jīng)2500rpm離心15min后，取土清液保存于一20℃。其中將12例PD患者CSF和15例正